微生物来源的Xa因子抑制剂F02Word文档格式.docx
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FactorXainhibitor;
Sesterterpenes
血栓的形成是心血管疾病（如心肌梗死、中风、深度静脉血栓、肺栓塞等）重要致病因素，抗血栓治疗一直是这类疾病抢救措施及预防策略的，其中抗凝血是抗血栓治疗的重要方法之一，因此，寻找更加安全、高效的抗凝血药物在治疗上具有重要的意义。
Xa因子（factorXactivated，factorXa）是一种丝氨酸蛋白酶，位于血液凝集级联的上游，处在连接内源性和外源性激活途径共同通路的中心位置，Xa因子抑制剂既能阻断内源性凝血亦能抑制外源性凝血的发生［1］。
Xa因子是凝血酶生成的限速成分，由于在血液凝集级联反应过程中还存在生物信号的放大，估计一个Xa因子抑制剂分子能抑制138个凝血酶分子的生理效果，Xa因子抑制剂可能比凝血酶抑制剂更为有效［2］。
Xa因子只单纯促进凝血，没有凝血酶抑制剂的副作用，因此，Xa因子抑制剂成为近年来抗凝血药物研究的之一，有些药物已经上市［如Organon公司和SanofiSynthelabo公司共同开发的磺达肝素钠（fondaparinuxsodium，商品名：
方达帕鲁）于2001年12月在美国获得FDA批准［3］］或正在开发中［4］。
本实验室建立了一个快速的高通量筛选方法，从大量土壤真菌代谢产物中筛选Xa因子抑制剂，筛选得到阳性菌株F022172。
本文报道其发酵、分离、结构鉴定和生物学活性。
1材料与方法
筛选用微生物的菌株
真菌菌株由本中心从云南和新疆采集的土壤中分离得到。
试剂及仪器
Xa因子和底物MCA（BocIleGluGlyArg7amido4methylcoumarinhydrochloride）购自美国Sigma公司；
色谱乙腈购自Merck公司；
Victor2多标计数仪（美国PE公司）；
中压层析系统（德国BUCHI公司）；
高效液相系统（美国Waters公司515泵和PDA检测器）；
高效液相柱PhenomeneC18（20mm×
250mm，10μm）；
核磁共振仪500MHz（Inova）；
质谱仪（AutospecUltima）。
Xa因子活性测定方法
活性测定方法由本中心建立，原理是Xa因子可以水解特定的荧光标记多肽底物，通过荧光值的变化计算抑制剂对酶的抑制活性。
活性测定反应在96孔板进行，样品孔中加入/LTris（，10mmol/LNaCl，10mmol/LCaCl2）、适量的酶液（Xa因子）和样品的DMSO溶液；
对照孔以DMSO代替样品溶液；
空白管以DMSO代替样品溶液并以Tris缓冲液代替酶液，在37℃保温15min，测定荧光F1（Ex355nm/Em460nm）；
各孔加入底物，37℃保温1h，测荧光F2。
其中，抑制率大于80%的样品为阳性。
样品抑制率（%）=［F2-F1］（对照）-［F2-F1］（样品）［F2-F1］（对照）-［F2-F1］（空白）×
100%
真菌F022172的培养
将菌株F02ZA2172斜面接种于种子培养基（淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉%，麦芽粉%，酵母%，CaCO3%，MgSO4·
7H2O%，NaCl%，），27℃，220r/min摇瓶培养3d。
按1%接种的量接种到固体培养基（大米%，黄豆饼粉%）27℃培养14d。
F02ZA2172的提取分离
F02ZA2172固体培养物2kg，用2000ml乙酸乙酯萃取，减压蒸去溶剂得到深褐色油状物。
上述粗提物经硅胶柱（×
50cm）色谱，正己烷乙酸乙酯梯度洗脱，每50ml收集一管，合并活性组分，减压蒸干。
活性物质部分用ODS反相中压柱色谱（MerckODSC18，40μm，×
50mm）进一步分离纯化，然后用制备型HPLC进行单组分的制备［流动相为CH3CNH2O（85∶15，V/V），流速6ml/min，检测波长240nm］，得到F022172A（）、B（）和C（）三个活性化合物。
2结果
F022172A、B和C的理化性质及结构
F022172A无色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax（MeOH）为241nm。
ESIMS的测定结果显示该化合物的分子量为，分子式为C25H38O3，1H和13CNMR数据见；
经紫外、质谱、核磁等理化数据分析并与文献［5］对照，确定该化合物为6epiophiobolinK，化学结构见。
F022172B无色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax（MeOH）为239nm。
紫外、质谱、核磁等理化数据分析并与文献［5］对照，确定该化合物为ophiobolinK，化学结构见。
F022172C无色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax（MeOH）为238nm。
ESIMS的测定结果显示该化合物的分子量为，分子式为C25H36O2，1H和13CNMR数据见；
紫外、质谱、核磁等理化数据分析并与文献［6］对照，确定该化合物为ophiobolinG，其化学结构见。
F022172A、B和C的生物活性
利用本中心建立的体外筛选模型，测定了6epiophiobolinK（F022172A）、ophiobolinK（F022172B）和ophiobolinG（F022172C）三个化合物对与凝血相关的几个酶的抑制活性，它们对Xa因子的活性在1mmol/L浓度以下，对凝血酶（thrombin）和纤溶酶（fibrinolysin）没有抑制活性，IC50分别为、和μg/ml。
3讨论
Ophiobolins（蛇孢假单壳素）是一族具有三环或四环结构的二倍半萜类化合物，具有杀线虫、抗真菌、抗细菌和细胞毒等多种生物活性［7］。
OphiobolinA是该类化合物中第一个被发现的，它的结构是通过其溴甲氧化衍生物的x射线单晶衍射得到的［8］，文献报道该化合物具有抑制钙活化的环核苷磷酸二酯酶和诱导L1210细胞凋亡的作用［9］。
OphiobolinK具有杀线虫的作用，而6epiophiobolinK没有活性［5］。
本研究测定了6epiophiobolinK（F022172A）、ophiobolinK（F022172B）和ophiobolinG（F022172C）三个化合物对与凝血相关的几个酶的抑制活性，发现在1mmol/L浓度下它们对凝血酶和纤溶酶没有抑制活性，只特异性的对Xa因子有抑制活性，而且ophiobolinK对Xa因子的抑制活性比6epiophiobolinK和ophiobolinG强8～18倍，进一步的构效关系研究需找到或分离
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