18天然产物提取工艺学40本Word格式.docx

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实验类型：

验证性实验实验学时：

4

实验要求：

必修适用专业：

食品生物技术

一、实验目的

1、通过氨基酸的分离，学习并掌握薄层层析的原理和操作技术；

2、掌握氨基酸的鉴定方法。

二、实验内容

1、制板

2、点样

3、层析

4、显色

三、仪器设备

仪器：

毛细管、电热吹风机、层析缸、小型玻璃喷雾器、层析板、铅笔、直尺、分析天平、量筒、烧杯、烘箱。

四、所需耗材

1、实验材料：

谷氨酸、组氨酸、脯氨酸标准品

2、试剂：

（1）氨基酸标准溶液：

0.01mol/L脯氨酸、谷氨酸、组氨酸标准溶液及混合溶液。

（2）硅胶G

（3）0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：

取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。

（4）展开溶剂：

按80:

10:

10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。

（5）0.25%的水合茚三酮溶液：

称取0.25g茚三酮，加100mL蒸馏水溶

解，避光保存。

（6）展层-显色剂：

按照10:

1比例（V/V）混匀展开剂和0.25%茚三酮溶液。

五、实验原理、方法和手段

1、实验原理

薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。

由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，广泛应用于对天然化合物的分离和鉴定。

薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。

2、实验方法和手段

本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的Rf值，以分离和鉴别混合氨基酸的成分。

移动速率Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

氨基酸的显色反应：

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。

6、实验步骤

（1）实验流程

（二）操作步骤

（1）调浆：

称取硅胶3g，加0.5%的羧甲基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状。

（2）涂布：

取洁净的干燥玻璃板a均匀涂层b。

（3）干燥：

将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h，自然晾干。

（4）活化：

70℃烘干60分钟。

（1）标记：

用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。

每个样品间相距1cm。

（2）点样：

用毛细管分别吸取氨基酸标准品及混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。

加样原点扩散直径不超过2mm。

点样后用电吹风轻轻吹干，必要时重复加样。

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。

盖好层析缸盖，上行展层。

当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线。

在90℃下烘干30min，即可显出各层斑点。

七、实验结果

1、记录各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离（a）及溶剂前缘至样品原点中心距离（b）

2、计算各种已知氨基酸和未知氨基酸色谱的Rf值：

3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。

八、实验注意事项

1、粘在玻璃板侧面边上的硅胶粉应去掉，否则在层析时会有较强的边缘效应。

2、整个层析过程中，避免用手接触层析板，必要时戴上手套。

3、重复点样时必须等第一点样品干后再点第二点，样点不能浸入到溶液中，可将层析缸盖涂上凡士林，防止层析液挥发。

九、预习与思考题

1、如何确定混合样品中的氨基酸组分？

2、薄层层析的原理是什么？

十、实验报告要求

1、用规范的实验报告纸。

2、写清实验的目的、原理、内容、方法、设备等。

3、本实验为验证性实验，写出实验结果。

实验二葡萄皮色素提取及稳定性探究

综合性实验实验学时：

1、掌握葡萄皮色素的提取原理和方法。

2、熟悉葡萄皮色素的性质。

1、葡萄皮色素的提取

2、研究温度、pH、H2O2对葡萄皮稳定性的影响。

分光光度计，干燥器，电热恒温水浴锅、电子天平、量筒、烧杯、烘箱。

鲜葡萄皮

95%无水乙醇、酒石酸、盐酸、丙酮、H2O2溶液

葡萄皮色素是一种水溶性天然食用色素，属于黄酮类化合物，是由花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物。

在自然界中广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到蓝等不同颜色。

作为一种天然食用色素，不仅无毒、资源丰富外，而且具有一定的营养和药理价值，在食品、药品、化妆品等领域都有着巨大的潜力和商业价值。

本实验利用葡萄皮色素溶于乙醇的性质提取葡萄皮色素，最大吸收波长在530nm左右，然后对葡萄皮花色苷在不同条件下的稳定性进行研究，分析温度、氧化性物质对葡萄皮花色苷的稳定性的影响。

六、实验步骤

（一）葡萄皮预处理与色素浸提流程

将葡萄皮与籽、梗分离。

将葡萄皮烘干,置干燥器内备用。

葡萄皮色素浸提流程:

葡萄皮→干燥→破碎（5g）→提取剂浸提（50mL乙醇在80℃水浴中浸提1小时）→过滤→葡萄皮色素粗提液→测定吸光度。

（二）稳定性研究

1、pH对色素颜色的影响

葡萄色素在不同的pH值范围内有不同的颜色，分别观察pH为3、6、10时葡萄色素的颜色。

2、温度对色素的影响

将葡萄皮色素溶液在不同温度下（30、40、50℃）保温30min,冷却后观察其颜色的变化，并测定色素溶液的吸光度值。

3、过氧化氢对色素的影响。

向葡萄皮色素溶液中加入不同浓度的H2O2,（0.02、0.06、0.1%）放置30min后，测定色素的吸光值，并观察颜色的变化。

1、记录实验现象

2、分析实验现象的原因。

1、不同品种的葡萄中含有的葡萄皮色素的最大吸收波长会有变化，实际操作过程中可进行调整。

1、说明葡萄皮色素的稳定性如何？

3、本实验为综合性实验，写出实验结果。

实验三青霉素的萃取与萃取率的计算

1、学会利用溶剂萃取的方法对料液进行提纯。

2、掌握碘量法测定青霉素含量的方法，并计算出青霉素的萃取率。

1、青霉素的提取

2、青霉素萃取率的计算

150ml棕色瓶（2个）、分液漏斗、100ml量筒、100ml烧杯（2个）、玻璃棒、酸式滴定管、铁架台、1ml移液管、10ml移液管、洗耳球、100ml容量瓶、精密pH试纸（包括pH2.4）。

青霉素钠、K2Cr2O3、Na2S2O3、无水Na2CO3、碘、KI、无水乙酸钠、冰醋酸、NaOH、浓HCl、可溶性淀粉、乙酸丁酯、浓硫酸。

（1）Na2S2O3（0.1mol/L）取Na2S2O3约2.6g与无水Na2CO30.02g，加新煮沸过的冷蒸馏水适量溶解，定容到100ml。

（2）碘溶液（0.1mol/L）取碘1.3g，加KI3.6g与水5ml使之溶解，再加HCl1～2滴，定容到100ml。

（3）乙酸乙酸钠（pH4.5）缓冲液100ml取83g无水乙酸钠溶于水，加入60ml冰醋酸，定容至1L。

（4）NaOH（1mol/L）4g/100ml

（5）HCl（1mol/L）8.3ml/100ml

（6）H2SO4（1mol/L）55.5ml/L

（7）淀粉指示剂称取可溶性淀粉0.5g，置于玛瑙研钵中，加少量除盐水研磨成糊状物，徐徐加入到100mL煮沸的除盐水中，继续煮沸1min，冷却后备用。

该试剂不宜存放，应在使用时配制。

萃取过程是利用在两个不混溶的液相中各种组分溶解度的不同，从而达到分离组分的目的。

本实验利用当pH=2.3时，青霉素在乙酸丁酯中比在水中溶解度大，因而可以将乙酸丁酯加到青霉素溶液中，并使其充分接触，使青霉素被萃取浓集到乙酸丁酯中，达到分离提纯的目的。

青霉素萃取率（%）=（萃取前青霉素含量－萃取后青霉素含量）/萃取前青霉素含量。

萃取前后青霉素含量的测定采用的是碘量法。

碘量法的基本原理为青霉素类抗生素经碱水解的产物青霉噻唑酸，可与碘作用（1mol青霉噻唑酸可与8mol碘原子反应，即青霉素：

I2=1：

4），根据消耗的碘量可计算青霉素的含量。

利用碘量法测定青霉素含量时，为了消除供试品中可能存在的降解。

剩余的碘用Na2S2O3滴定（Na2S2O3：

I2=2：

1）。

1、Na2S2O3的标定取K2Cr2O30.15g于棕色瓶中，加入50ml水使之溶解，再加KI2g，溶解后加入稀H2SO440ml，摇匀，密塞，在暗处放置10min。

取出后再加水25ml稀释，用Na2S2O3滴定临近终点时，加淀粉指示剂3ml，继续滴定至蓝色消失，记录消耗的体积。

2、青霉素的萃取

（1）用电子天平称取0.12g青霉素钠，溶解后定容到100ml（以此模拟青霉素发酵液进行实验操作）。

（2）准确移取10ml青霉素钠溶液，用稀H2SO4调节pH2.3～2.4，取15ml乙酸丁酯液，与青霉素钠溶液混合，置分液漏斗中，摇匀，静置30min。

（3）溶液分层后，将下方萃余相置于烧杯中备用，将上方萃取液回收。

3、萃取率的测定

（1）测定萃取前青霉素钠溶液消耗的碘取5ml定容好的青霉素钠溶液于棕色瓶中，加1mlNaOH（1mol/L）后放置20min，再加1mlHCl（1mol/L）与5ml乙酸-乙酸钠缓冲液，精密加入碘滴定液（0.1mol/L）5ml，摇匀，密塞，在20～25℃暗处放置20min，用Na2S2O3滴定液（0.1mol/L）滴定，临近终点时加淀粉指示剂3ml，继续滴定至蓝色消失，记录Na2S2O3消耗的体积（V前）。

（2）测定空白消耗的碘另取5ml定容好的青霉素钠溶液于棕色瓶中，加入5ml乙酸-乙酸钠缓冲液，再精密加入碘滴定液（0.1mol/L）5ml，摇匀，密塞，在20～25℃暗处放置20min，用Na2S2O3滴定液（0.1mol/L）滴定，临近终点时加淀粉指示剂3ml，继续滴定至蓝色消失，记录Na2S2O3消耗的体积（V空白）。

（3）测定萃取后萃余相中青霉素钠消耗的碘取萃余相5ml于棕色瓶中，按步骤1的方法进行测定，记录Na2S2O3消耗的体积（V后）。

1、根据Na2S2O3：

I2=2:

1,分别计算操作步骤3萃取率的测定中各步滴定的碘的量I①,I②,I③

2、萃取前与青霉素反应的碘：

总I2=I②－I①

萃取后与青霉素反应得碘：

余I2=I②－I③

3、根据青霉素：

I2=1:

8计算：

萃取前青霉素含量和萃取后青霉素含量

4、计算：

萃取率=（萃取前青霉素含量－萃取后青霉素含量）/萃取前青霉素含量。

1、青霉素盐必须溶解完全，严禁溶解液发白或有颗粒。

2、溶解过程中，尽量缩短溶解时间，溶解完后立刻进行萃取。

1、结合教材萃取一章的内容，考虑实验室与大生产中有何不同？

实验四淀粉的提取及性质分析

1、掌握淀粉的提取方法。

2、熟悉淀粉跟碘的反应和淀粉水解生成葡萄糖的反应。

1、淀粉的提取

2、淀粉的性质分析

植物样品粉碎机、离心机、分析天平、电子天平、量筒、三角瓶；

离心管、小电炉；

烧杯、三脚架、石棉网、滴管。

甘薯

95%的乙醇、碘溶液（碘酒或碘化钾的碘溶液）、稀硫酸（1:

5）、碳酸钠、氢氧化钠溶液（5%）、硫酸铜溶液（2%）、斐林试剂

淀粉主要由直链淀粉（约占20%）和支链淀粉（约占80%）组成。

直链淀粉能溶于热水，跟碘作用显现蓝色。

支链淀粉不溶于水，但能在水中胀大而润湿、跟碘作用显现紫红色。

酸性氯化钙溶液与磨细的含淀粉样品共煮，可使淀粉轻度水解。

同时钙离子与淀粉分子上的羟基络合，这就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成为淀粉溶液。

淀粉在稀酸作用下能发生水解，生成一系列产物，最后得到葡萄糖。

本实验利用水浸法提取甘薯淀粉；

研究淀粉的性质：

淀粉遇碘变蓝、淀粉酸水解、斐林试剂验证还原糖存在。

（一）淀粉的提取

甘薯去皮→切成小块（0.3×

0.3×

0.3cm3）→每组15g于搅拌器中→加蒸馏水240mL→捣碎1min→分成4份→3层纱布过滤→滤液置50℃恒温水浴30min→倾去上层液体→25mL蒸馏水重新悬浮白色沉淀→漏斗过滤（3000r/m,10min离心）→少量水洗沉淀（离心）→105℃烘干→称重

（二）淀粉性质的分析

1、淀粉跟碘的反应：

取淀粉1g加少量蒸馏水调成糊状，取1mL制备好的淀粉溶液于试管中，然后加入1滴碘液，淀粉溶液立即会显深蓝色。

加热，颜色褪去，冷却，蓝色又出现。

2、淀粉的水解：

加40mL淀粉溶液于烧杯中，再加稀硫酸1mL，煮沸5分钟，取出1mL热溶液放在试管里，使其迅速冷却，滴入1滴碘溶液，出现蓝紫色。

以后每隔2min取一次试样检验，共计五次，可以看到不同大小的糊精颗粒对碘溶液显现紫红色、橙红色、橙黄色及黄色。

3、把已经水解的淀粉溶液用碳酸钠中和硫酸，使溶液略显碱性。

取出1mL，加入盛有斐林试剂的（甲和乙各3mL的混和液）试管里，摇和均匀，加热煮沸，即有红色氧化亚铜沉淀生。

1、计算淀粉的得率。

2、实验现象描述与分析。

1、淀粉提取时水浴温度不能超过50℃，否则会因溶解度增大而减少产量；

2、倾出上清时要尽可能小心，避免沉降的淀粉被震动起来。

1、如何选择生化物质实验中的实验材料？

有何标准？

2、材料的破碎方法有哪些？