重庆应用基础研究项目申请书重庆科委Word下载.docx

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但既往研究多是针对临床疾病的基因流行病学调查，单一SNP单一人群的研究对不同人种间遗传背景的差异不够重视，针对SNP位点的功能研究不够深入。

我们前期工作中发现，在重庆汉族人群中Klotho基因G-395A多态性与动脉僵硬度增高有相关性[4]，初步的功能分析提示G-395A可能是潜在的具有调控意义的SNP位点（regulatorySNP，rSNP）,对这一SNP位点进行功能分析，明确该位点在Klotho基因表达调控中的作用及其机制，有助于老年疾病的早期预防，并为抗衰老药物靶点提供新的理论依据。

主要参考文献：

[1]WangY,SunZ.Currentunderstandingofklotho.AgeingResRev.2009,8

（1）:

43-51.

[2]RussellSJ,KahnCR.Endocrineregulationofageing.NatRevMolCellViol.2007,8:

681-91

[3]Kuro-OM.Klothoandaging.BiochimBiophysActa.2009Feb18.[Epubaheadofprint]

[4]Kuro-oM.Klothoasaregulatorofoxidativestressandsenescence.BiolChem.2008,389（3）:

233-41.

[5]BahloM,StankovichJ,SpeedTP,etal.DetectinggenomewidehaplotypesharingusingSNPormicrosatellitehaplotypedata.HumGenet,2006,119:

38-50.

[6]KawanoK,OgataN,ChianoM,etal.Klothogenepolymorphismsassociatedwithbonedensityofagedpostmenopausalwomen.JBoneMinerRes2002,17:

1744–1751.

[7]王虎林,司良毅,孙兰英,等.Klotho基因G-395A多态性与动脉硬化的相关性研究.中华老年心脑血管病杂志,2008,10:

96-98.

（二）、研究现状和发展趋势

目前研究现状和发展趋势（重点项目需附查新报告）

单核苷酸多态性是人类基因组中分布广泛、密度高、易于批量检测且相对稳定的第三代遗传标记，在疾病易感性、药物敏感/抵抗研究中发挥着越来越重要的作用。

由于SNP在基因组中不仅仅是定位标记，有一定数量的SNP直接影响了基因表达调控及蛋白活性。

近年来SNP与疾病遗传关联研究急剧增加，如何更好的利用这些研究结果成了当前一个重要课题。

与编码序列的SNP相比，非编码序列中SNP密度更高，其中有不少具有调控意义的SNP。

对于调控性SNP进行深入的功能分析是当前研究的一个重要趋势[1]。

在对Klotho基因的SNP研究中，有多个SNP位点与老年疾病有遗传关联。

其中位于5’侧翼的G-395A多态性位点在体外实验显示，G/A替换后的DNA序列结合核蛋白能力有差异，近年来逐渐受到重视。

已有研究表明G-395A多态性在特定人群中与骨质疏松、冠心病、高血压、脑血管病、认知功能障碍有相关性[2-5]，在汉族人群中我们也发现G-395A位点与动脉僵硬度有相关性。

这些临床疾病关联研究显示该位点在多种老年疾病中有重要意义，但该位点对Klotho基因表达调控的影响到目前为止尚不清楚，针对该位点的功能研究尚未见报道。

通过生物信息学分析显示Klotho基因的5’侧翼区无典型的TATA盒，其表达调控方式目前仍然不清楚。

通过firstEF（http:

//rulai.cshl.org/tools/FirstEF/）及promoterscan（http:

//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）等启动子预测工具，分析其启动子可能位于Klotho基因5’侧翼约-500bp范围内，其中存在5个SP1结合位点，符合缺少TATA盒的启动子缺点。

我们近期根据这5个SP1结合位点设计PCR引物进行了启动子删减分析，成功构建了4个启动子缺失突变的报告基因载体，与内参载体共转染HEK293细胞及hela细胞，报告基因活性检测显示在-300bp－-500bp存在启动子活性的序列。

G-395A位点也处于区域，由于体外G/A替换可使该位点所在序列核蛋白结合能力有差异，我们提出G-395A这个SNP位点是潜在调控性SNP位点的假说。

运用Genomatix（http:

//www.genomatix.de/cqi-bin）及MAPPER（http:

//mapper.chip.org）等转录因子结合位点预测工具分析发现G-395A位点碱基变异可能影响MZF1、ppar、E2F三个转录因子的结合，但哪个转录因子的结合受到影响及影响程度未经实验证实，细胞水平的验证也未见报道。

本项目拟在原工作基础上，进一步完善启动子序列删减分析和双报告基因活性检测，对G-395A位点进行功能定位，确认该位点是处于核心启动子区域，还是在增强子、沉默子等调控元件序列中。

根据生物信息学的预测，运用EMSA结合单克隆抗体实验，对G/A替换可能影响的转录因子进行预测。

针对确认的转录因子，运用其表达载体共转染和序列特异性RNA干扰技术，从正反两方面证实G-395A的功能。

[1]ChorleyBN,WangX,CampbellMR,etal.Discoveryandverificationoffunctionalsinglenucleotidepolymorphismsinregulatorygenomicregions:

currentanddevelopingtechnologies.MutatRes.2008,659（1-2）:

147-57。

[2]ImamuraA,OkumuraK,OgawaY,etal.KlothogenepolymorphismmaybeageneticriskfactorforatheroscleroticcoronaryarterydiseasebutnotforvasospasticanginainJapanese.ClinChimActa.2006,371（1-2）:

66-70.

[3]RheeEJ,OhKW,YunEJ,etal.RelationshipbetweenpolymorphismsG395AinpromoterandC1818Tinexon4oftheKLOTHOgenewithglucosemetabolismandcardiovascularriskfactorsinKoreanwomen.JEndocrinolInvest.2006,29（7）:

613-8.

[4]RheeEJ,OhKW,LeeWY，etal.ThedifferentialeffectsofageontheassociationofKLOTHOgenepolymorphismswithcoronaryarterydisease.Metabolism.2006,55（10）:

1344-51.

[5]王虎林,肖航,司良毅.Klotho基因与心血管病的关系及研究现状.中华老年心脑血管病杂志,2007,9:

136-138.

（三）、拟解决的主要科学问题

详细阐述所要解决的主要科学问题内涵

项目组在前期工作中注意到SNP与临床疾病的遗传关联研究因不同人种的遗传背景结果有一定差异，因而选择G-395A在重庆人群中做了分析，结果提示G-395A与动脉僵硬度有相关性。

明确该位点仅仅是一个遗传标记还是具有调控作用SNP，对Klotho相关的多种老年疾病研究有重要意义。

因此本项目拟进一步明确G-395A在启动序列中的顺式元件作用，阐明在细胞水平该位点对基因表达调控的影响及其机制。

通过研究为Klotho基因的表达调控研究提供新的线索，也为防治Klotho基因相关的多种老年疾病提供新的思路，为老年疾病治疗提供新的药物作用靶点。

（四）、主要研究内容

研究内容要围绕科学问题拟定，要突出重点，避免分散或拼盘现象。

1.进一步完善启动子序列删减分析，确定Klotho基因的核心启动子，对G-395A位点进行功能定位。

前期结果提示G-395A多态性位点所在的约200bp序列有启动子活性。

下一步拟继续对Klotho基因5’侧翼-300bp至-500bp的这个片断进行缺失突变，构建报告基因载体，通过报告基因活性检测明确G-395A位点是否处于核心启动子位置，或者是否具有增强子或者沉默子作用。

2.EMSA结合单克隆抗体分析，明确其G/A替换影响的转录因子，对G-395A位点进行功能预测。

通过HEK293细胞核蛋白与生物素标记的DNA探针进行作用，电泳显影分析，再用MZF1、ppar、E2F抗体进行超迁移反应，明确G/A替换对DNA探针与核蛋白相互作用的影响，明确G/A替换影响的转录因子。

3.转录因子表达载体共转染及位点特异性RNA干扰，从正反两方面验证G/A替换对基因转录的影响。

根据第2步确认的转录因子，购买或自行构建其表达载体，与含Klotho基因启动子的报告基因载体共转染HEK293细胞，明确上调转录因子表达后G/A替换对Klotho基因启动子启动活性的影响。

构建特异性的RNA干扰载体，经共转染实验比较启动活性。

以上可从正反两方面验证特定转录因子的作用。

（五）、总体研究方案

阐述学术思路、技术路线、与国内外同类研究相比的创新点与特色、可行性分析等。

1.学术思想：

由于Klotho基因G-395A多态性与多种老年疾病有遗传关联，而该SNP位点又位于启动子区域，文献报道该位点的变异可引起与核蛋白结合能力的差异，因而我们提出G-395A位点是个潜在调控性SNP位点的假说。

通过实验证实G-395A位点对转录因子结合的影响，并对所影响的转录因子进行鉴定，则可以明确该位点在Klotho基因表达调控中的作用，为人群中Klotho相关老年疾病的防治提供线索。

而该位点有望成为新的药物作用靶点，为从基因水平上预防和治疗老年病提供新的理论支持。

如下图所示：

2.

技术路线：

本项目分G-395A功能定位、功能预测和功能证实三部分进行实施，实验路线如下页图所示。

3.创新点与特色：

既往Klotho基因SNP与临床疾病关联研究取得了很大进展，为老年病早期预防提供了多个SNP定位标记，但对可能有调控意义的SNP重视不够，调控性SNP的功能研究有待进一步深入。

本项目首次对抗衰老基因Klotho的调控性SNP进行系统的功能分析，鉴定G-395A多态性位点影响的转录因子，并在细胞水平进行验证，有助于明确该位点变异对Klotho基因表达调控的意义，为老年病防治及药物靶点筛选提供理论支持。

4.可行性分析：

本项目立论依据充分，实验路线明确，所用仪器在西南医院综合实验中心均能满足，所需试剂均有商品化提供，所用到的实验技术本项目组成员均已掌握。

前期已有一定前期工作基础，能保证按时完成。

本项目的技术路线图：

（六）、现有工作基础和条件

1）、相关研究工作积累。

2）、项目实施所具备的工作条件，包括实验平台和大型仪器设备等。

1.相关工作积累

项目组已经通过临床病例对照研究在重庆汉族人群中发现G-395A多态性与动脉僵硬度有相关性。

为研究其功能，已经构建pGL3-Basic-967kl、pGL3-Basic-498kl、pGL3-Basic-312kl及pGL3-Basic-137kl4个启动子序列缺失突变的报告基因载体并测序验证（有测序图备索），转染HEK293和Hela细胞的预实验中提示G-395A位点所在序列有启动子活性。

下图分别为4个载体的双酶切电泳图及报告基因实验图表。

图1：

由上至下分别是1kbDNAladder、pGL3-Basic-967kl、pGL3-Basic-498kl、pGL3-Basic-312kl、pGL3-Basic-137kl和100bpDNAladder

图2：

分别为阴性对照、阳性对照及4个载体转染两种细胞的报告基因相对活性。

项目组已经用EMSA法成功检测过NF-Κb、AP-1、PPAR-α等转录因子，如下图所示。

显示项目组可以完成EMSA实验。

项目组构建过小鼠FGFR3可控性RNAi载体并转染细胞进行验证，可完成本项目中RNA干扰载体构建及细胞转染工作。

2.项目组所具备的工作条件：

项目组可依托对全医院开放的西南医院综合实验中心进行全部课题研究，该实验中心的仪器能满足本项目需要。

（七）、研究队伍

项目负责人和主要学术骨干研究工作简历、主要学术业绩、近五年发表的代表性论文或专著目录（不超过3篇）、获得国家及省部级科技奖励情况（1500字以内）

1.项目负责人：

徐强：

男，38岁，讲师，主治医师，医学硕士，重庆市医学会老年医学专业委员会委员。

1995年毕业于华西医科大学。

2002年第三军医大学获心血管专业硕士学位。

目前在职攻读老年医学专业博士学位。

作为负责人已完成第三军医大学中青年基金《糖基化终产物促发动脉粥样硬化斑块泡沫细胞形成机制研究》（XG200524）,已结题。

2005年参与的《急性心肌血运障碍机制及多因素干预研究》获重庆市科技进步奖三等奖（第四作者）。

近年以第一作者发表论著8篇，参编专著两部。

代表性论著如下：

[1]徐强，司良毅，赵晓兰，王璋。

大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡Caspase3活性变化规律及药物对其影响。

第三军医大学学报，2003，25（15）：

1355－1357

[2]徐强，司良毅，赵晓兰，张红，唐维平.Caspase3活性对老年大鼠心肌缺血再灌注损伤影响。

实用老年医学，2004，18

（2）：

71－74

[3]YANGQi-hong,XUQiang,ZHANGHongandSILiang-yi.EffectsofRosiglizatoneonExpressionofAcyl-coenzymeA:

CholesterolAcyltransferase-1InducedbyAdvancedGlycationEnd-productsinTHP-1macrophages.JournalofMedicalCollegesofPLA,2008,23:

127-136.

2.主要学术骨干：

司良毅：

男，52岁，教授，主任医师，医学博士，博士生导师。

重庆市老年医学专委会主任委员，全军老年医学专委会副主任委员。

1983年毕业于中国人民解放军第三军医大学，继续攻读心血管专业，并获硕士及博士学位。

1998年任西南医院老年病科主任。

是本项目负责人的的博士导师，负责项目进展质控。

杨启红：

女，34岁，主治医师，医学博士。

1998年毕业于同济医科大学，2004年7月于第三军医大学获医学硕士学位。

2008年7月于第三军医大学获医学博士学位。

熟悉细胞生物学、分子生物学和蛋白技术，擅长EMSA实验，本项目中负责EMSA实验。

发表论文中以下文章涉及到本项目的实验技术：

[1]杨启红，陈林，朱京慈.小鼠胫骨骨折愈合中FGFR3基因表达的原位定位.第三军医大学学报，2005，24（5）：

215-218.

[2]杨启红，徐强，司良毅.糖基化终产物对人单核/巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响.中华老年心脑血管病杂志，2008,10:

214-217.

[3]杨启红，徐强，张红，司良毅。

糖基化终产物对THP-1巨噬细胞酰基辅酶A:

胆固醇酰基转移酶-1表达的影响.第三军医大学学报，2008,30:

1630-1633.

袁侨英：

女，31岁，主治医师，医学博士。

2007年7月在重庆医科大学获心血管内科博士学位，在读博士研究生期间，先后参与导师黄晶教授承担的国家自然基金重点项目、国家科学自然基金主任基金、重庆市科委攻关课题、重庆市卫生局课题等项目。

现在第三军医大学西南医院老年特诊科从事临床及科研工作。

博士论文题目：

心腔内超声辐照增加基因表达治疗犬心肌梗死。

熟悉临床研究及数据分析工作，在本项目中负责数据分析。

代表性论文如下：

[1]YUANQiao-ying,HUANGJing,ZHUZhengwei,ZHENGYongping,DENGChang-ming,LIUDi-chuan,WANGZhigang,Guorui.Catheter-basedIntramyocardialInjectionofNakedDNAEncodingEGFPandIntracardiacIrradiationtoEnhanceGeneExpressionbyanUltrasoundCatheterinDogsABSTRACT.InternationalJournalofCardiology.（2006ImpactFactor:

2.234）. 

2008,2:

55-56.

[2]袁侨英,覃数,司良毅.辛伐他汀对急性心肌梗死大鼠RhoA表达及心室重塑的影响.第三军医大学学报.2008，12（30）1170-1172.

[3]袁侨英,黄晶,朱正伟,邓辉胜,李进嵩.导管超声辐照犬心肌组织的生物效应[J]，重庆大学学报（自然科学版）.2007,30

（1）:

120-122.

王虎林：

男，31岁，博士研究生。

2001年第四军医大学，2005年起在第三军医大学攻读硕士学位，2007年开始提前攻读博士学位。

熟悉分子克隆技术，本项目中启动子删减分析。

与本项目有关的论文有：

[1]王虎林,肖航,司良毅.Klotho基因与心血管病的关系及研究现状.中华老年心脑血管病杂志,2007,9

（2）:

[2]王虎林，孙兰英，司良毅，孟萍，肖航.Klotho基因G-395A多态性与动脉硬化的相关性研究.中华老年心脑血管病杂志,2008,10

（2）：

96-98.

张宜华：

男，26岁，博士研究生，2004年7月毕业于第三军医大学，2007年7月第三军医大学大坪医院野战外科研究所硕士学位，2007年9月至今在第三军医大学西南医院老年科攻读博士学位。

熟练掌握载体构建、细胞转染等工作,本项目中负责载体构建和细胞转染。

与本课题有关的论文有：

张宜华,苏楠,杜晓兰,赵玲,陈林.小鼠FGFR3可控性RNAi载体的构建和抑制效率验证.免疫学杂志,2007,23（3）:

331－334.

（八）、申请者承担项目的情况

已完成项目

项目编号

项目名称

项目类型

负责人

起止年限

项目经费

XG200524

糖基化终产物促发动脉粥样硬化斑块泡沫细胞形成机制研究

第三军医大学中青年基金

徐强

2005-2007

3万

在研项目

无

正在申请的项目

我保证以上的所填内容完全属实，若有虚假，本人将负全部责任。

如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守《重庆市自然科学基金计划项目管理办法》的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料，按要求做好结题工作。

申请人签字：

年月日