生物化学试验指导扬州大学医学院留学生教育Word格式文档下载.docx

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注意：

洗前检查毛刷顶端铁丝是否裸露，洗刷时不可用力过猛，以免损坏仪器。

B．定量玻璃仪器，如滴管，吸量管等。

先用自来水冲洗晾干，然后于洗液中浸泡数小时，取出待沥净洗液后，用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3遍。

C．比色杯用毕立即用蒸馏水反复冲洗，避免用碱液或强氧化剂清洗，切不可用试管刷或粗糙布（纸）擦拭。

②清洁的标准：

玻璃仪器洗净后，以倒置后内壁不挂水珠为清洁的标准。

③铬酸洗液的配制

A．称取5gK2Cr2O7置于500ml烧杯中，加5ml水使其尽量溶解。

缓慢加入l00ml浓硫酸，边加边搅拌，待冷却后使用。

铬酸洗液一般呈棕色粘稠溶液，遇有机溶剂或水过多时变为绿色。

B．使用注意事项：

洗液是强氧化剂，有很强的腐蚀性，使用时不要滴溅到衣物及实验台等处，拿取洗液中的玻璃仪器时，需戴耐酸手套，切忌用手直接拿。

3．移液操作

（1）吸量管的使用

①吸量管的分类

奥氏吸量管：

此类吸管中下部有一呈橄榄型的膨大。

每根奥氏吸量管只有一个刻度，适用于量取粘度较大的溶液。

规格为0.5ml，1ml，2ml。

移液管：

形似奥氏吸量管，中部膨大处呈圆筒状。

每根移液管只有一个刻度。

规格为5ml，l0ml，15ml，20ml，25ml。

刻度吸量管：

每根吸量管上有许多等分的刻度，刻度标记有自上而下和自下而上两种，规格为0.1ml，0.2ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，10ml等。

刻度吸量管上方印有各种彩环，以示容积区别。

红色单环：

0.1ml，5ml；

红色双环：

0.5ml；

黑色单环：

0.2ml，2ml；

黄色单环：

1ml；

桔色单环：

10ml。

②吸量管的选取原则：

在一次完成移液的前提下，应选用容量较小的吸量管，对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管。

③刻度吸量管的操作

A．执管：

拇指与中指执吸量管上部，使吸量管保持垂直，食指控制管上口调节流速，刻度朝向操作者。

B．取液：

把吸量管插入液体，用洗耳球吸取液体至所需量取刻度上方，移开洗耳球，迅速用食指压紧管口，然后抽离液面。

（必要时用小滤纸片将管尖端外围拭净）。

C．调准刻度：

用食指控制液体至所需刻度（此时液体凹面，视线和刻度应在同一水平）。

D．放液：

移开食指，让液体自然流入容器内。

此时，管尖应接触容器内壁，但不应插入容器的原有液体中。

待液体流尽，将最后液滴吹出或转动吸量管使其沿容器内壁流出。

E．洗涤：

吸取血浆、尿液及粘稠试剂的吸量管，用后应及时用自来水冲洗干净。

如果吸取一般试剂的吸量管，可待实验完毕后再洗。

①对于刻度由上至下的吸量管应尽量使用上端刻度。

②管尖残液是否需吹，视具体情况而定。

一般来说，1ml及lml以下的均需吹出；

>

1ml的视标记而行。

如吸量管上方标有“吹”或“◇”形符号，则残液需吹出；

标有“快”字，应使残液自然流下。

奥氏吸量管均为吹出式。

（2）可调式移液器的使用

①可调式移液器的结构

注：

推动按钮内部的活塞分2段行程，第一档为吸液，第二档为放液，手感十分清楚。

②操作

调调节轮至所需体积值；

套上枪头，旋紧；

垂直持握可调式移液器用大拇指按至第一档；

将抢头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原；

将可调式移液器移出液面，必要时可用纱布或滤纸拭去附于枪头表面的液体（注意；

不要接触枪头孔口）；

排放时，重新将大拇指按下,至第一档后，继续按至第二档以排空液体。

注意：

移取另一样品时，按卸尖按钮弃掉枪头并更换新枪头。

4．混匀

样品和试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。

为使反应体系内各物质迅速地接触，必须借助于外力的机械作用。

常用的混匀方法有以下几种：

①旋转法：

手持容器，使溶液作离心旋转。

适用于未盛满液体的试管或小口器皿如锥形瓶。

②指弹法：

一手执试管上端，另一只手轻弹试管下部，使管内溶液作旋涡运动。

③搅动法：

使用干玻璃棒搅匀，多用于溶解烧杯中的固体。

④混匀器法：

将容器置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。

混匀时谨防容器内液体溅出或被污染；

严禁用手堵塞管口或瓶口振摇。

5．保温

调节温度设定钮至所需温度，温度达到要求后将容器放入恒温水浴箱内计时保温。

水浴箱中水分要充足,实验过程中要随时监测温度，并及时调节。

6．离心沉淀法

当颗粒小而不均一，沉淀粘稠或容积小又需精确定量时，往往采取离心沉淀法。

①离心前检查：

取出所有套管，起动空载的离心机，观察是否转动平稳；

检查套管有无软垫，是否完好,内部有无异物；

离心管与套管是否匹配。

②离心原则

平衡：

将一对离心管放入一对套管中，置于天平两侧，用滴管向较轻一侧的离心管与套管之间滴水至两侧平衡。

对称：

将已平衡好的一对管置于离心机中的对称位置。

③离心操作

对称放置配平后的一对管后，取出多余的套管，盖严离心机盖。

调节转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，计时。

离心完毕后，缓慢将转速调回零。

待离心机停稳后取出离心管，并将套管中的水倒净，所有套管放回离心机中。

④注意事项

A．离心的起动、停止都要慢，否则离心管易破碎或液体从离心管中溅出。

B．离心过程中，若听到特殊响声，应立即停止离心，检查离心管。

若离心管已碎，应清除并更换新管；

若管未碎，应重新平衡。

7．分光光度计的使用

1）分光光度法原理及操作详见附录

2）比色杯的使用方法

比色杯有两个透光面和两个非透光面，光线从其透光面穿过到达检测系统。

用手持非透光面，加2/3体积的液体即可，用镜头纸或绸布擦净光面的污物或液滴。

比色操作的时间应尽量短，比色完毕应立即用蒸馏水冲净比色杯。

洁净的比色杯只能倒置于比色杯架上，决不允许散乱地放在操作台上，更不允许放在仪器上。

比色杯中若有水，不能直接用于比色，可用少量待测液清洗内壁。

3）仪器的维护

分光光度计属精密仪器，应精心爱护使用，防震、防潮、防腐蚀。

比色时间应尽量短，不比色时应关闭光门，以保护光电转换器。

比色杯要保持清洁，其透光面不应用手触摸或接触粗糙物体，比色杯中的液体应适量，如待测液为强酸强碱液体，应尽快比色，以防止破坏比色杯。

比色杯不能用毛刷清洗。

附:

分光光度计的练习使用

1．取试管3支，如下表操作（单位：

ml）

管号

1（空白）23

蒸馏水

2%硫酸铜

5.02.50

02.55.0

2．混匀，于650nm处比色，并记录数值。

3．关机，清洗比色杯，倒置于比色杯架上，晾干。

[常用生化仪器]

1.烧杯（beaker）

2.试管（testtube）

3.离心管（centrifugetube）

4.刻度吸量管（scaledpipet）

5.滴管（dropper）、搅棒（stirringrod）

6.漏斗（funnel）

7.混匀器（vortex）

8.恒温水浴箱（waterboth）

9.离心机（centrifuge）

10.分光光度计（spectrophotometer）

11.可调式移液器（pipettman）

[思考题]

1．判断玻璃仪器清洗干净的标准是什么?

2．简述刻度吸管的正确使用方法；

若量取0.4ml液体，应选取哪种规格的刻度吸量管?

3．离心操作的基本原则是什么?

如何才能做到?

4．简述分光光度法测定物质浓度的原理。

5．试述722分光光度计的使用步骤。

实验二血清蛋白的盐析与定量

1．掌握盐析的原理和方法。

2．掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。

3．了解血清蛋白质定量测定的临床意义。

[实验原理]

在蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质就会被沉淀，这种作用称为盐析。

其机制与下列因素有关：

高浓度的盐离子可与蛋白质分子争夺表面水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离，使蛋白质带电量减少。

盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白质变性，经透析或加水稀释后仍可溶解，盐析是可逆过程。

正常人的血清蛋白中清蛋白占绝大部分，约60％以上，其余为球蛋白，两者比例为1.5～2.5∶1。

清蛋白在水中的溶解性大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。

蛋白质含量的测定是利用双缩脲法，其基本原理是：

蛋白质（或肽）分子中含有许多肽键，与双缩脲结构（H2NOC-NH-CONH2）类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫红色的化合物（称双缩脲反应）。

在一定的浓度范围内，化合物的颜色深浅与蛋白质（或肽）的含量成正比，故可用比色法测定蛋白质（或肽）的含量。

因含有肽键的物质才有此反应，故氨基酸不能用此方法测定含量。

正常血清中含有多种蛋白质，其总量为6-8g/100ml。

在某些病理情况下，如营养不良，肝脏疾患，可因蛋白质合成减少，或因肾病综合征，由于蛋白质从尿中流失而降低；

而在严重脱水情况下，由于血液浓缩可致测出结果增高。

血清蛋白浓度升高不如其降低的临床意义大，而清/球比值的改变更具有临床意义。

[操作步骤]

（一）血清蛋白的盐析

1．取1ml未知血清加入离心管，逐滴滴加饱和硫酸铵1ml，边加边混匀，（观察现象）。

2．室温静置5分钟后，3000rpm，离心7分钟，将上清小心移入样品收集管内。

3．盐析上清的稀释（1∶30）：

取盐析上清xml，用0.9％NaCl溶液稀释30倍，备用（按实际用量：

每人3ml准备）。

（二）血清蛋白含量测定

1．稀释血清（1∶60）：

取未知血清xml，加0.9％NaCl溶液稀释60倍，备用（按实际用量：

2．取大试管9支，编号，按下表操作（单位：

123456789

标准蛋白

稀释血清

稀释上清

蒸馏水

双缩脲试剂

00.30.60.91.21.82.4--

-------3.0-

--------3.0

3.02.72.42.11.81.20.6--

3.03.03.03.03.03.03.03.03.0

3．各管混匀后370C水浴30分钟，在波长540nm处进行比色，以1号管调零，记录各管的光密度值。

（三）数据处理

1．以蛋白质含量为横坐标，测出的光密度值为纵坐标，作出两者的关系曲线。

2．根据未知管的光密度值，利用上述曲线计算未知血清的蛋白质浓度。

血清蛋白的浓度（g/100ml）＝图示值÷

0.05×

100

盐析上清蛋白的浓度（g/100ml）＝图示值÷

0.1×

3．计算清蛋白与球蛋白的比值。

比值＝

[注意事项]

1．双缩脲试剂必须贮存在棕色瓶内，可长期使用，长期放置后，如有暗红色沉淀则不能用。

2．血清样品必须新鲜，不得溶血。

3．本实验为定量实验，各试剂取量一定要准确。

[器材]

1．15支试管/组

2．离心管

3．吸量管

4．可见光分光光度计

5．血清

[试剂]

1．标准蛋白溶液（2mg/ml）：

0.2g牛血清白蛋白（BSA）溶于100ml0.9％NaCl溶液中。

2．双缩脲试剂：

称取CuSO4．5H2O1.5和酒石酸钾钠6.0g，以少量蒸馏水溶解，再加10%NaOH溶液300ml，KI1.0g，然后加水到1000ml，用棕色瓶避光保存。

3．饱和硫酸铵溶液

1．盐析使蛋白沉淀的原理及特点是什么？

2．沉淀血清中的清蛋白和球蛋白分别用何种硫酸胺？

3．简述考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度的原理。

实验三酵母RNA的提取及成分鉴定

1、掌握酵母中核酸组成及提取方法。

2、熟悉鉴定RNA成分的方法原理。

酵母（yeast）细胞中所含的核酸主要是RNA，而DNA含量很少，故本实验采用酵母提取RNA。

由于酵母细胞中所含的核蛋白不溶于水和醋酸，但能溶于稀碱，所以，先用稀碱加热煮沸处理，使RNA成为可溶性的钠盐而与酵母中其它的组分分离。

然后，加酒精沉淀溶液中的RNA，最后，加酸将其完全水解，然后用下列方法鉴定其中组分。

1．磷酸与钼铵试剂作用生成磷酸钼铵酸，后者被还原成钼蓝，借此鉴定核酸中的磷。

2．核糖与强酸共热生成糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟基甲苯）反应，缩合成绿色化合物，以此鉴定戊糖的存在。

3．嘌呤，如鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤等，能与硝酸银中的银离子生成溶解度很小的棕色嘌呤银盐沉淀，鉴定嘌呤的存在。

1．酵母细胞中RNA的制备

（1）取1g干酵母置研钵中，加入7.5ml0.04mol/LNaOH磨3～5分钟，使其成匀浆。

（2）将酵母匀浆倒入大试管中,在沸水中加热15分钟，加热时常摇动。

（3）流水冷却，2000rpm离心10分钟,把上清液倒入试管，弃去沉淀。

（4）加3mol/LHAc3滴，立即摇匀酸化。

（5）将上述溶液猛力摇匀后，徐徐倒入盛有10ml酸化乙醇的大试管中，即有白色沉淀析出。

（6）2000rpm离心10分钟，倾去上清液，保留沉淀物作下列实验。

2．RNA水解及产物检查

（1）水解：

将其沉淀物置于中号试管中，加入2.5ml1.5mol/LH2SO4煮沸10分钟水解。

（2）取水解液作以下试验：

①戊糖检测：

取水解液10滴加3,5-二羟甲苯试剂6滴混和后，置沸水中加热10分钟，观察颜色变化。

②嘌呤检测：

取硝酸银10滴加氨水至沉淀消散再加入水解液10滴，加热约5～8分钟，观察颜色变化。

③磷酸检测：

取水解液10滴于中号试管中，再加钼酸铵试剂10滴，摇匀，加4％维生素C6滴，摇匀，沸水中加热，观察颜色变化。

附：

操作流程可用下图表示：

干酵母（含核蛋白）

7.5mlNaOH

研磨5′（使核蛋白中核酸与

蛋白分离）

匀浆

倒入大试管

△15′时常摇动（蛋白变性）

2000rpm离心10′

弃去沉淀（含蛋白质）

上清液（含核酸）

HAc三滴、酸化、摇匀

徐徐倒入盛有10ml酸化乙醇的大试管

2000rpm离心10′

弃上清（含杂质）

沉淀（含核酸钠盐）

2.5mlH2SO4煮沸水解10′

水解液

水解液10滴加3,5-二AgNO3滴加氨水至沉淀水解液10滴，加

羟甲苯6滴，混匀，沸消失加水解液10滴，钼酸铵10滴，摇匀，

水浴10′△5-8′加4％Vc6滴，摇匀

沸水△10′

观察各管的颜色变化并得出结论

1．充分研磨，充分混匀。

2．取上清和沉淀时切勿弄混。

3．煮沸时用大试管并注意安全，离心时用小试管（代替离心管）。

1．离心机

2．电磁炉

3．研钵

4．离心管

5．吸量管

6．干酵母

1．钼酸铵试剂：

取25克钼酸铵溶于300ml蒸馏水中。

另将75ml浓硫酸慢慢加入125ml蒸馏水中,混匀，冷却。

将以上两液合并即为钼酸铵溶液。

2．酸性乙醇溶液：

每100ml95％乙醇中含浓H2SO41ml。

3．3,5二羟甲苯试剂：

取浓盐酸100ml，加入三氯化铁100mg，及二羟甲苯100mg，溶解后置棕色瓶中（此试剂必须临用前新鲜配制）。

4．5％AgNO3溶液

5．4％维生素C

6．2.5mol/LH2SO4

7．0.04mol/LNaOH

8．3mol/LHAc

9．氨水

1．核酸分几大类?

它们在细胞内分布、结构、功能如何?

2．核酸的基本组成单位及连接键是什么？

RNA、DNA分别水解后的终产物是什么?

3．本实验水解核酸采用的是何种方法?

4．两次离心后所保留和丢弃的刚好相反（上清和沉淀）为什么?

实验四血清蛋白的醋酸纤维素膜电泳

1．掌握电泳的基本原理及其主要影响因素。

2．熟悉利用醋酸纤维素膜电泳分离血清蛋白质的方法及结果。

血清中各种蛋白质的等电点均低于pH7.0，所以在pH8.6的缓冲液中都电离成负离子，在电场中向正极泳动。

由于血清中各种蛋白质的等电点不同，在同一pH条件下所带电荷量不同；

此外，各种蛋白质的分子量大小不同，因而在电场中的泳动速度不同。

蛋白质分子带的电荷量越多、分子量越小，则泳动速度越快；

反之，则慢。

以醋酸纤维素膜作为介质进行电泳可将血清蛋白区分为5条区带。

从正极向负极，按电泳快慢依次为清蛋白、l,、2、和球蛋白。

待蛋白质分离后，用染色剂染色。

蛋白质的量与结合的染料量成正比，故可用比色法测定其相对含量。

1．点样

（1）薄膜预处理：

醋酸纤维素膜（12×

5cm）于pH8.6缓冲液中浸泡过夜。

（2）将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去膜上多余的缓冲液。

（3）使醋酸纤维素膜的粗面朝上，距一端约1.5cm处用铅笔画线，表示点样位置。

（4）X光片沾取少量血清平直印在点样线上，待血清完全渗入薄膜后移开。

2．电泳：

将膜的点样面向下，置于盐桥上，点样端靠近阴极，另一端靠近阳极，密闭电泳槽，110V，电泳50-60分钟后关闭电源。

3．染色：

将膜取出，置于盛有氨基黑10B的染色液中染色5分钟。

4．脱色：

用水洗去多余的染液，浸于脱色液漂至本底呈白色，蛋白质色带清晰为止，取出晾干，指出各种蛋白质在膜上的位置。

5．定量分析：

将电泳染色漂洗后的膜条，按分离的各种蛋白质区带分别剪下，并以最宽区带为标准，于空白部位分别补取一膜条，分别置于含0.4mol/LNaOH溶液4ml的试管中，不时摇动30分钟，使兰色洗脱。

以空白管做对照，在波长650下比色，测定各管的吸光度值后按下述方法进行计算并分析实验结果。

6．计算

吸光度总和（T）=A+l+2++

计算各部分蛋白质的百分比，如：

白蛋白（%）=A/T×

100%

1．点样时应尽量点成一条线，并且保证一次成功。

2．点样处应距薄膜1.5～2cm。

电泳时避免与盐桥接触,以防样品扩散。

1．水平式电泳槽

2．电泳仪

3．点样器

4．平头镊子

5．醋酸纤维素膜

6．血清

1．巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）：

巴比妥钠12.76g

巴比妥1.66g

dH20定容至1000ml

2．染液：

氨基黑10B0.5g

甲醇50ml

冰醋酸10ml

dH2O40ml

3．脱色液：

95％乙醇45ml

冰醋酸5ml

dH2O50ml

4．前沿指示剂（示踪剂）：

0.05％溴酚蓝，0.005NaOH

附1：

电泳法中血清蛋白的相对含量：

清蛋白；

67-73％l球蛋白：

3-4％

2球蛋白：

5-9％球蛋白：

6-9％

球蛋白：

11-14％

附2：

血清蛋白的等电点和分子量：

蛋白质名称等电点（pH）分子量

清蛋白4.8869.000

l球蛋白5.06200.000

2球蛋白5.06300.000

球蛋白5.1290.000-150.000

球蛋白6.85～7.5156.000～300.000

1．何谓电泳？

简述醋酸纤维素膜电泳分离血清蛋白质的原理。

2．本实验所用的蛋白染料为何种物质？

3．用醋酸纤维素膜电泳分离血清蛋白质可出现几条区带，其中含量最多的是哪一种？

实验五血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳-盘状电泳

1．了解聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离混合蛋白质的原理

2．熟悉并掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术和实验方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，这种凝胶由丙烯酰胺（acrylamide,Acr）和交联剂N,N’-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺（N,N’-methylene-bis-acrylamide,Bis）聚合而成。

聚丙烯酰胺凝胶电泳具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、用样量少（1～100μg）和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶，用于蛋白质，核酸等物质的分离、定性和定量分析。

还可结合去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS），以测定蛋白质亚基分子量。

根据凝胶形状不同可分为盘状电泳和板状电泳。

盘状电泳是在直立的玻璃管内，利用不连续的缓冲液pH值进行电泳而命名的；

同时，样品混合物被分开后形成的带很窄，呈圆盘状，因此圆盘电泳这个名字成了不连续性和盘状的双关语。

垂直板状电泳是将丙烯酰胺聚合成方形或长方形薄片状，薄片可大可小。

其优点是：

①在同一条件下可电泳多个要比较的样品：

②一个样品在第一次电泳后可将薄片转90度进行第二次助电泳，即双向电泳，可提高分辨力：

③便于电泳后进行放射自显影的分析。

缺点是制备凝胶时较盘状电泳复杂，所需电压较高，电泳时间较长。

1．丙烯酰胺的聚合

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）与交联剂甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，经过聚合交联形成含有亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链又通过甲叉桥交连起来的三维网状结构的凝胶体。

聚合过程的引