玉竹抑制蛋白质非酶糖基化活性成分研究Word文档格式.docx

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3-（4’-hydroxybenzyl）-5,7-dihydroxy-6-methoxy-8-methylchroman-4-one（I），3-（4’-hydroxybenzyl）-5,7-dihydroxy-6,8-dimethylchroman-4-one（II），3-（4’-hydroxybenzyl）-5,6-dimethoxy-7-hydroxy-8-methylchroman-4-one（III），3-乙氧甲基-5,6,7,8-四氢-8-吲哚里嗪酮（3-ethoxymethyl-5,6,7,8-tetrahydroindolizin-8-one，IV），3-异丁基-6-异丙基-1,4-二氧杂环己烷-2,5-二酮（3-isobutyl-6-isopropyl-1,4-dioxane-2,5-dione，V），2-氨基-1-（3,5’-二甲氧基-4’-羟基苯基）-1,3-丙二醇[2-animo-1-（3,5’-dimethoxy-4’-hydroxyphenyl）propane-1,3-diol，VI]。

1仪器与材料

Yanako显微熔点测定仪（温度计未校正）；

BRUKERAV-500型核磁共振波谱仪；

FinniganLCQTM离子阱质谱仪；

输液泵NPL-500，日本精密科学株式会社；

示差折光检测器RI-102，日本昭光电工株式会社。

SHY-2型水浴恒温振荡器，江苏金城国胜实验仪器厂；

960MC型荧光分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司。

制备高效液相色谱柱：

Shim-packPREP-ODS（H）KITcolumn（φ20×

250mm）No.20253393；

SenshuPakC6H5-3152-Ncolumn（φ8×

150mm）No.03202；

KaseisorbLCODSSupercolumn（φ10×

250mm）No.8155147。

柱色谱用十八烷基键合硅胶[ODS（PEGASILPREPODS-5015-12A）]，日本Senshu科学株式会社；

薄层色谱用硅胶板（Silicagel60F254），ODS板（RP-18F254），德国Merck公司。

盐酸氨基胍，Fluka公司；

牛血清白蛋白，北京鼎国生物技术有限责任公司；

D-葡萄糖，Sigma公司。

氘代甲醇，日本和光纯药工业株式会社；

甲醇为色谱纯，美国FISHER公司；

水为超滤水；

其它试剂均为分析纯。

玉竹药材购于吉林省宏检医药物资经销公司，经长春中医药大学李文亭教授鉴定为百合科黄精属植物玉竹Polygonatumodoratum（Mill.）Druce的干燥根茎。

2实验方法

2.1蛋白质非酶糖基化抑制活性测定方法

在牛血清白蛋白10mg/mL和葡萄糖200mmol/L磷酸盐缓冲液（200mmol/L，pH7.4）的蛋白质非酶糖基化体系中分别加入供试品500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL（sample），氨基胍0.3125mmol/L作为阳性对照（positivesample），牛血清白蛋白10mg/ml和葡萄糖200mmol/L磷酸盐缓冲液的蛋白质非酶糖基化体系作为对照（control），加入供试品的牛血清白蛋白10mg/mL磷酸盐缓冲液作为空白A（blankA），牛血清白蛋白10mg/mL磷酸盐缓冲液作为空白B（blankB），于37℃孵育7天后，采用荧光分光光度计在370/440nm波长处测定荧光值，按下式计算抑制率。

抑制率%=[1-（Sample-BlankA）/（Control-BlankB）]×

100%

2.2总提取物的提取与分离部位的分离

取玉竹药材59kg，加10倍量乙醇回流提取二次，每次2小时，滤过，提取液减压回收乙醇，减压干燥得总提取物10.4kg（收率17.62%）。

取总提取物7.85kg，加水使溶解，依次用三氯甲烷、正丁醇振摇提取，提取液减压回收，得三氯甲烷分离部位250g、正丁醇分离部位600g。

2.3分离组分的分离

取三氯甲烷有效部位40g，加甲醇溶解得甲醇可溶部27.4g。

经十八烷基键合硅胶柱色谱，以甲醇-水（7：

3，9：

1，10：

0）梯度洗脱，得23个分离组分Fr.YZ-1（12.6679g），YZ-2（2.7417g），YZ-3（501.4mg），YZ-4（424.4mg），YZ-5（575.9mg），YZ-6（358.3mg），YZ-7（440.3mg），YZ-8（230.3mg），YZ-9（315.2mg），YZ-10（489.8mg），YZ-11（156.5mg），YZ-12（388.7mg），YZ-13（86.8mg），YZ-14（581.4mg），YZ-15（799.5mg），YZ-16（627.5mg），YZ-17（173.2mg），YZ-18（186.5mg），YZ-19（265.6mg），YZ-20（392.9mg），YZ-21（539.2mg），YZ-22（17.3mg），YZ-23（305.0mg）。

2.4有效组分的分离

Fr.YZ-2经十八烷基键合硅胶柱色谱，以甲醇-水（4：

6，6：

4，10：

0）洗脱得Fr.YZ-2-1（1.0107g），YZ-2-2（113.5mg），YZ-2-3（184.7mg），YZ-2-4（180.4mg），YZ-2-5（48.7mg），YZ-2-6（137.1mg），YZ-2-7（170.9mg），YZ-2-8（92.9mg），YZ-2-9（67.5mg），YZ-2-10（61.6mg），YZ-2-11（225.5mg），YZ-2-12（274.7mg），YZ-2-13（126.7mg）；

YZ-2-3经制备高效液相色谱（色谱柱：

Shim-packPREP-ODS（H）KIT，φ20×

250mm；

流动相：

甲醇-水=35：

65；

流速：

2.8ml·

min-1；

检测器：

示差折光检测器RI）得化合物IV（5.9mg）和V（3.1mg）；

YZ-2-6经制备高效液相色谱（色谱柱：

SenshuPakC6H5-3152-N，φ8×

150mm；

1.5ml·

示差折光检测器RI）得化合物VI（6.0mg）。

Fr.YZ-3经制备高效液相色谱（色谱柱：

KaseisorbLCODSSuper，φ10×

甲醇-水=60：

40；

示差折光检测器RI）得化合物I（160.4mg）。

Fr.YZ-4经制备高效液相色谱（色谱柱：

示差折光检测器RI）得化合物II（112.2mg）。

Fr.YZ-5经制备高效液相色谱（色谱柱：

甲醇-水=70：

30；

示差折光检测器RI）得化合物III（67.2mg）。

3实验结果

3.1不同分离组分对蛋白质非酶糖基化抑制作用

不同浓度分离组分对蛋白质非酶糖基化抑制率见表1。

结果表明分离组分Fr.YZ-2~Fr.YZ-9对蛋白质非酶糖基化反应有明显地抑制作用。

表1玉竹有效部位不同分离组分对蛋白质非酶糖基化的抑制作用

组分

抑制率（%）

500μg/ml

250μg/ml

125μg/ml

62.5μg/ml

Fr.1

92.80

59.57

33.23

17.74

Fr.2

100.97

101.18

87.42

57.42

Fr.3

100.00

98.49

60.86

Fr.4

99.68

97.63

89.78

68.60

Fr.5

99.14

90.54

71.18

38.92

Fr.6

82.37

59.46

30.54

18.92

Fr.7

91.18

70.65

44.09

Fr.8

93.23

75.70

47.20

26.45

Fr.9

91.08

69.35

49.89

20.97

Fr.11

80.86

58.92

32.04

Fr.12

57.96

32.15

5.48

-6.02

Fr.13

38.17

30.43

16.13

2.26

Fr.14

27.63

13.44

-3.87

-11.72

Fr.15

54.09

36.56

18.60

7.74

Fr.16

58.71

30.00

4.09

-6.56

Fr.17

64.11

40.22

21.29

9.68

Fr.18

74.52

38.71

17.85

-1.94

Fr.19

72.69

43.01

24.41

12.58

Fr.20

67.85

36.02

12.47

-0.86

Fr.21

45.05

27.10

-7.10

-21.94

AG（0.3125mM）71.09

3.2结构鉴定

化合物I：

淡黄色粉末；

1H-NMR（CD3OD，500MHz）δ7.06（2H，d，J=8.4Hz，H-2’，6’），6.74（2H，d，J=8.5Hz，H-3’，5’），4.30（1H，dd，J=11.4，4.2Hz，H-2a），4.15（1H，dd，J=11.4，6.9Hz，H-2b），3.10（1H，dd，J=13.8，4.6Hz，H-9a），2.81（1H，m，H-3），2.68（1H，dd，J=13.8，10.2Hz，H-9b），3.73（3H，s，-OCH3），1.98（3H，s，-CH3）；

13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ199.67（C-4），159.01（C-5），158.65（C-7），157.24（C-4’），152.97（C-8a），131.17（C-2’，6’），130.18（C-1’），129.15（C-6），116.41（C-3’，5’），105.28（C-8），102.43（C-4a），70.44（C-2），61.58（-OCH3），48.25（C-3），33.23（C-9），7.19（-CH3）；

HRESI-MSm/z331.1179[M+H]+（计算值C18H19O6331.1182）。

综合解析以上数据，确定其结构为3-（4’-hydroxybenzyl）-5,7-dihydroxy-6-methoxy-8-methylchroman-4-one。

化合物II：

1H-NMR（CD3OD，500MHz）δ7.05（2H，d，J=8.4Hz，H-2’，6’），6.73（2H，d，J=8.5Hz，H-3’，5’），4.23（1H，dd，J=11.4，4.2Hz，H-2a），4.07（1H，dd，J=11.4，7.2Hz，H-2b），3.08（1H，dd，J=13.8，4.6Hz，H-9a），2.75（1H，m，H-3），2.62（1H，dd，J=13.8，10.3Hz，H-9b），1.99（3H，s，6-CH3），1.97（3H，s，8-CH3）；

13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ200.04（C-4），163.89（C-7），160.56（C-5），159.10（C-8a），157.12（C-4’），131.12（C-2’，6’），130.35（C-1’），116.37（C-3’，5’），104.76（C-6），103.69（C-8），102.72（C-4a），70.03（C-2），48.12（C-3），33.10（C-9），7.88（8-CH3），7.41（6-CH3）；

ESI-MSm/z315[M+H]+，m/z313[M–H]–。

综合解析以上数据，确定其结构为3-（4’-hydroxybenzyl）-5,7-dihydroxy-6,8-dimethylchroman-4-one。

化合物III：

1H-NMR（CD3OD，500MHz）δ7.16（2H，d，J=8.6Hz，H-2’，6’），6.87（2H，d，J=8.7Hz，H-3’，5’），4.31（1H，dd，J=11.3，4.2Hz，H-2a），4.15（1H，dd，J=11.3，7.0Hz，H-2b），3.13（1H，dd，J=13.8，4.7Hz，H-9a），2.84（1H，m，H-3），2.72（1H，dd，J=13.8，10.0Hz，H-9b），3.77（3H，s，5-OCH3），3.73（3H，s，6-OCH3），1.98（3H，s，8-CH3）；

13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ199.55（C-4），160.01（C-4’），159.02（C-5），158.66（C-7），152.95（C-8a），131.45（C-1’），131.17（C-2’，6’），129.17（C-6），115.10（C-3’，5’），105.31（C-8），102.44（C-4a），70.48（C-2），61.58（6-OCH3），55.70（5-OCH3），48.17（C-3），33.16（C-9），7.19（8-CH3）；

HRESI-MSm/z343.1179[M–H]–（计算值C19H19O6343.1182）。

综合解析以上数据，确定其结构为3-（4’-hydroxybenzyl）-5,6-dimethoxy-7-hydroxy-8-methylchroman-4-one。

化合物IV：

淡黄色油状物；

1H-NMR（CD3OD，500MHz）δ6.93（1H，d，J=4.1Hz，H-1），6.27（1H，d，J=4.1Hz，H-2），4.53（2H，s，H-10），4.15（2H，t，J=5.8Hz，H-5），3.54（2H，q，J=7.0Hz，H-11），2.58（2H，t，J=6.6Hz，H-7），2.27（2H，m，H-6），1.20（3H，t，J=7.0Hz，H-12）；

13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ190.46（C-8），137.09（C-3），132.59（C-9），114.61（C-1），112.65（C-2），66.65（C-11），64.59（C-10），43.61（C-5），36.80（C-7），24.48（C-6），15.35（C-12）。

综合解析以上数据并和文献[4]对照，确定其结构为3-乙氧甲基-5,6,7,8-四氢-8-吲哚里嗪酮（3-ethoxymethyl-5,6,7,8-tetrahydroindolizin-8-one）。

化合物V：

白色粉末；

1H-NMR（CD3OD，500MHz）δ3.95（1H，ddd，J=9.1，4.4，0.9Hz，H-3），3.78（1H，dd，J=4.4，1.0Hz，H-6），2.23（1H，ttd，J=7.0，6.9，4.5Hz，H-7），1.87（1H，m，H-11），1.76（1H，ddd，J=9.3，9.1，4.6Hz，H-10a），1.61（1H，ddd，J=9.8，9.1，4.9Hz，H-10b），1.05（3H，d，J=7.1Hz，H-8），0.98（3H，d，J=6.6Hz，H-12），0.97（3H，d，J=6.8Hz，H-9），0.96（3H，d，J=6.5Hz，H-13）；

13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ171.28（C-5），169.67（C-2），61.58（C-6），54.43（C-3），45.96（C-10），33.67（C-7），25.33（C-11），23.56（C-12），21.89（C-13），19.27（C-8），17.80（C-9）。

综合解析以上数据，确定其结构为3-异丁基-6-异丙基-1,4-二氧杂环己烷-2,5-二酮（3-isobutyl-6-isopropyl-1,4-dioxane-2,5-dione）。

化合物VI：

黄色固体；

1H-NMR（CD3OD，500MHz）δ6.66（2H，s，H-2’，5’），4.72（1H，d，J=4.5Hz，H-1），4.27（1H，brdd，J=9.3，6.9Hz，H-3a），3.89（1H，dd，J=9.3，3.9Hz，H-3b），3.85（6H，s，H-OCH3×

2），3.14（1H，m，H-2）；

13C-NMR（CD3OD，125MHz）δ149.42（C-3’，5’），136.36（C-4’），133.21（C-1’），104.71（C-2’，6’），87.64（C-1），72.80（C-3），55.54（C-2）。

综合解析以上数据，确定其结构为2-氨基-1-（3,5’-二甲氧基-4’-羟基苯基）-1,3-丙二醇[2-animo-1-（3,5’-dimethoxy-4’-hydroxyphenyl）propane-1,3-diol]。

4、讨论

糖尿病肾病的基本病理改变包括肾小球肥大，细胞外基质堆积，基底膜增厚和肾小球硬化，上述病变的发生与AGEs均有一定的联系。

肾小球系膜细胞上有AGEs受体，AGEs与系膜细胞上特异性受体结合后，能增加系膜细胞对细胞因子如细胞黏附分子、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、单核细胞趋化因子-1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的释放和细胞外基质的产生，进而导致肾小球肥大和肾小球硬化的发生。

AGEs能与一些胶原蛋白发生交联，使蛋白质在组织中沉积增加，细胞外基质成分经非酶糖基化后具有抗基质降解酶的能力，在体内降解缓慢，表现为系膜基质堆积，肾小球和肾小管基底膜增厚，选择性通透能力丧失和蛋白尿发生。

AGEs还参与糖尿病肾病肾血管病变和血液动力学改变的发生，AGEs与血管内皮细胞上AGEs受体结合后使血管壁通透性增加，减少内皮细胞表面抗凝酶的表达，增加前凝血因子的活性，加速糖尿病血管病的形成，能通过灭活一氧化氮影响肾脏血流动力学。

大量研究证实，AGEs在糖尿病肾病的发生机制中起关键作用，作为糖尿病肾病治疗的新靶点，AGEs抑制剂将成为一类新型的糖尿病肾病治疗药物。

本研究在采用STZ诱导糖尿病大鼠模型确定玉竹对肾脏保护作用有效部位基础上，采用牛血清白蛋白-葡萄糖（BSA-Glu）反应体系模型筛选为指导，应用现代色谱和光谱技术从有效部位中分离和鉴定了6个化合物，为开发蛋白质非酶糖基化抑制剂提供了有价值的先导化合物和科学依据。

REFERENCES

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