毕业论文 脱落酸和水杨酸对9号淡水小球藻生长及总脂含量的影响研究Word格式.docx
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20mg/LsalicylicacidcontributesmosttothemicroalgaeChlorella9cellssynthesisandaccumulationofliquid,andtheliquidpercontentishighest,1.6timesthatofthecontrolgroup.However,highconcentrationsofhormonesuppressiononthemicroalgaeChlorella9cellsgrowth,thehighgrowthrateandhighlipidcontentofmicroalgaeareincontradiction,theycanhardlybebothhighsimultaneously.
Keywords:
microalgaeChlorella9,abscisicacid,salicylicacid,growthproperty,lipidaccumulation
目录
摘要
ABSTRACT（英文摘要）
目录
第一章引言1
1.1课题的背景和意义1
1.29号小球藻2
1.3脱落酸与水杨酸概况4
1.3.1不同植物激素对小球藻的生长影响4
1.3.2脱落酸（ABA）4
1.3.3水杨酸（SA）5
1.4微藻油脂提取技术6
第二章实验方法8
2.19号小球藻的培养8
2.1.1藻种8
2.1.2藻种培养8
2.2实验材料8
2.2.1药品与试剂8
2.2.2仪器9
2.3实验方法9
2.3.1激素的配置9
2.3.29号小球藻的诱导10
2.3.3实验培养条件10
2.3.49号小球藻细胞生长的测定11
2.3.59号小球藻细胞的收集11
2.3.6总脂含量的测定11
第三章结果与讨论13
3.1激素对9号小球藻细胞生长特性的影响13
3.1.19号小球藻细胞形态的观察13
3.1.29号小球藻细胞生长的测定13
3.1.39号小球藻细胞生长的讨论14
3.29号小球藻细胞的总脂含量15
3.2.1外源脱落酸对9号小球藻细胞总脂含量的影响15
3.2.2水杨酸对9号小球藻细胞总脂含量的影响17
第四章结论19
参考文献20
致谢23
附录24
第一章引言
1.1课题的背景和意义
当今世界，石油是一个国家的经济和社会发展的命脉。
随着全球石油需求量的增长，预计在2050年即本世纪中叶化石石油资源将会消耗殆尽。
世界各国不得不考虑加快石油替代原料的研究与开发步伐，其中生物柴油被视为一种可再生的取代能源越来越受到重视[1]。
如今我国对石油的需求量已居世界第二，石油一旦出现危机必将会严重影响我国经济的发展与社会的稳定，因此寻找新一代的生物柴油原料已经迫在眉睫[2]。
生物柴油作为可再生生物燃料之一，具有低CO2排量，几乎不含硫化物以及生物降解性高等优势已成为生物质能源研究开发的热点[3]。
生物柴油作为一种新型的清洁能源，其本身的开发利用得到了更为广泛的关注。
生物柴油是指来自生物体的油脂经转酯作用而形成的单烷基脂肪酸酯。
从目前的情况来看，以高等植物、动物等油脂为原料生产的生物柴油根本无法满足人们的需求。
微藻相对其他能源作物，具有生长速率快，培养周期短，生物积累量高以及占地面积少等特点，备受研究者关注[4]。
同时，微藻与部分光合细菌可利用CO2进行光合作用，在体内积累生成大量碳氢类化合物可供自身能源消耗，并通过代谢在体内积累油脂等物质,且部分微藻相对于细菌具有较高的油脂含量[5]。
因而被视为新一代的，甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料[2]。
藻类作为数量群庞大的生物质，成为了生物柴油载体的研究热点。
当今可高效转化能量的植物最多也只能将太阳辐射能的10%~12%转化为化学能，而微藻的光能转化效应为20%左右。
美国可再生实验室（NREL）通过现代生物技术建成了“工程微藻”，即硅藻类的一种“工程小环藻”。
在实验室条件下可使“工程微藻”中油脂含量增加到60%以上，户外生产也可增加到40%以上，而在一般自然状态下微藻的油脂含量为5%~20%[6]。
“工程微藻”中油脂含量的提高主要是乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的作用，乙酰辅酶A羧化酶基因在微藻细胞中的高效表达，在控制油脂积累水平方面起到了重要作用。
小球藻为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，一般分布在土壤和淡水水域中,有的还以内共生体的形式出现在无脊椎动物体内[7]。
细胞内含有丰富的脂类物质，小球藻细胞干重中脂类的含量由4.5%~86%不等。
小球藻细胞中的总脂类经皂化后可分为三个组分：
脂肪酸、难皂化物质和水溶性的皂化产物。
小球藻细胞中脂类含量的增加主要是由于脂肪酸积累的结果。
9号小球藻（MicroalgaeChlorella9）作为一种淡水小球藻，其不饱和脂肪酸的含量明显高于许多植物[8]。
另外生长的小球藻在外界胁迫条件下总脂的含量会发生变化。
本实验拟通过向9号小球藻培养液中分别加入SA、ABA两种激素，并且设置不同浓度的激素的量，测定这两种激素对9号小球藻生物量以及总脂含量。
通过研究这两种激素对9号小球藻生长特性的影响，寻找到最适合小球藻细胞生长及含脂量最高的激素浓度。
1.29号小球藻
9号小球藻属于绿藻门（Chlorella）绿球藻目（Chlorococcales）卵囊藻科（Oocystaceae）。
9号小球藻是一种单细胞蛋白核小球藻，细胞多呈球形，细胞壁薄，色素体呈杯状，几乎充满整个细胞。
9号小球藻具有一个很明显的蛋白核，直径为3至5μm[9]。
小球藻的分布式极为广泛的，在海洋、湖泊、池塘、沟渠、树皮和湿润土壤等环境中都可以生长繁殖。
小球藻细胞的灰分含量在1.36%~20.21%之间，其中碳49.51%~70.71%，氢6.78%~10.53%，氮1.17%~14.11%，氧17.87%~34.40%；
蛋白质含量为7.3%~88%，碳水化合物为5.7%~38%，脂类为4.5%~86%[9]。
小球藻藻细胞中蛋白质的含量与其生长环境有直接关系，如果蛋白核小球藻生长在良好的环境中，其细胞中的蛋白质含量一般高于50%。
小球藻细胞中的脂类存在形式主要是脂肪酸，其不饱和脂肪酸的含量明显高于其他植物[8]。
在氮饥饿的生长条件下，蛋白核小球藻在生长过程中可积累形成高达86%的脂类，而在正常的小球藻细胞中，脂类含量为25%。
在正常条件和氮饥饿条件下生长的小球藻在脂肪组成上没有明显差异。
小球藻细胞中不饱和脂肪酸的含量明显高于许多植物[8]。
小球藻是被最早开发的藻类蛋白，早在20世纪60年代初，就已经开始工厂化生产。
美国可再生能源实验室（NREL）在20世纪80年代初对多种微藻进行了基础研究为利用微藻生产生物柴油提供了很多有价值的信息。
日本20世纪末通过微藻吸收火力发电厂烟气中的CO2来生产生物能源，建立起了光生物反应器的技术平台以及微藻生物能源开发的技术方案。
我国生物柴油的研究与开发起步很晚，但发展速度较快，一部分科研成果已经达到国际先进水平[2]。
1890年，荷兰微生物学家Beijerinck首先在琼脂平板上成功分离出小球藻，1919年，OttoWarburg在实验室里将小球藻用于研究植物生理学，实验结果证实了小球藻是一种光能利用效率很高的自养型植物[10,11]。
在20世纪40年代后期，美国、德国、以色列和日本开始了对小球藻规模化培养的研究，已解决第二次世界大战期间的能源问题和战后饥饿问题[12]。
在二战期间，还利用小球藻的规模培养物筛选抗菌物质[13]。
20世纪60年代，日本出现了小球藻商业化生产。
与此同时，美国与俄罗斯科学家进行了“太空藻类学”研究，以小球藻作为宇宙飞船飞行时的光和气体交换器[14,15]。
1971年Takechi以醋酸盐作为碳源在池塘中装配环流搅拌器，建立了混养培养方法[16]。
20世纪90年代小球藻的异样培养技术，特别是高细胞浓度培养技术的研究得到了较深入的发展[17,18,19]。
近期对于小球藻的研究则多集中在小球藻的产油研究和营养研究上。
微藻生物柴油成套技术涵盖多个技术环节，是一个复杂的系统工程，包括微藻的筛选和培育，获得性状优良的高含油量藻种，在光生物反应器中吸收阳光、CO2等，生成微藻生物质，最后经过采收、加工，转化为微藻生物柴油[20]。
美国、日本、欧洲等发达国家20世纪70、80年代就认识到了微藻作为替代能源资源的巨大价值。
1978年，美国能源部通过国家可再生能源实验室启动的一项利用微藻生产生物柴油的“水生生物种计划”，耗资近5亿美元，研究人员经过十多年的努力，开展了从微藻生物资源普查，到藻种选育，再到微藻规模培养等一系列卓有成效的探索工作。
这一项目的启动与开展大大推动了微藻可再生能源的研究与开发。
20世纪90年代，日本国际贸易和工业部资助了一项名为“地球研究更新技术计划”的项目，耗资近3亿美元，分离出1万多种的微藻。
但由于当时石油价格低廉，这些开创性的研发工作没有继续下去。
进入21世纪以后，石油价格快速飙升，使得对微藻的研究迅速繁荣起来，微藻生物柴油技术也取得了长足的进步。
在美国、澳洲、日本、西欧、印度和南非，无论是政府还是企业，都投入大量资金来进行产油微藻的开发。
这些研究的发展和技术的进步，有助于进一步降低微藻生物柴油的生产成本，使其大规模应用早日得以实现[20]。
1.3脱落酸与水杨酸概况
1.3.1不同植物激素对小球藻的生长影响
郝宗娣等人通过向原始小球藻中加入不同的植物激素，发现不同的植物激素对原始小球藻生长及油脂含量具有一定的影响。
研究发现植物激素对植物的生长与对藻细胞中油脂积累具有一定的促进作用，但并没有得出有利于小球藻生长及油脂积累的最适浓度[21]。
1.3.2脱落酸（ABA）
脱落酸（abscisicacid）是一种具有倍半萜结构的植物激素，广泛存在高等植物中,对植物生长起调控作用[22]。
天然脱落酸为白色结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯与三氯甲烷等，难溶于醚、苯等，水溶解度3~5g/L（20℃）。
脱落酸的分子为式为C15H20O4，分子量是264.3095。
脱落酸的稳定性较好，常温下放置两年，其有效成分含量基本不变，但应在干燥、阴凉、避光处密封保存。
脱落酸水溶液对光敏感，属强光分解化合物。
脱落酸生物合成的途径主要有两条：
1.类萜途径（terpenoidpathway）。
脱落酸的合成是由甲瓦龙酸（mevalonicacid,MVA）经过法尼基焦磷酸（farnesylpyrophosphate,FPP），再经过一些未明的过程而形成脱落酸，此途径亦称为C15直接途径。
2.类胡萝卜素途径（carotenoidpathway）。
有直接途径与间接途径两种，通常认为在高等植物中，主要以间接途径合成ABA。
直接途径是指从C15化合物（FPP）直接合成ABA的过程；
间接途径则是指从C40化合物经氧化分解生成ABA的过程。
脱落酸在植物整个生长发育过程中都有作用。
研究证明，ABA对植物抵御不良环境起着极其重要的作用，它在高等植物中主要是作为一种抗胁迫的激素来研究的。
利用植物生长抑制剂ABA稍微抑制小球藻的高速异养生长，可以增加小球藻的脂类物质积累，从而解决异养小球藻脂肪含量下降问题。
2007年，孟春晓等通过向对数生长期的雨生红球藻中加入不同浓度的脱落酸（ABA）溶液，进行胁迫培养，得出一定浓度的脱落酸可以促使雨生红球藻合成与积累虾青素[23]。
1.3.3水杨酸（SA）
水杨酸（salicylicacid）是一种植物体内产生的简单酚类化合物，广泛存在于高等植物中。
纯品是一种带状态结晶或轻质的结晶性粉末，化学式为C6H4（OH）（COOH），分子量是138.121，比重1.443。
水杨酸易溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯、丙酮、松节油，不易溶于水，20℃时溶解度为每100毫升0.2克。
水杨酸在植物界中普遍存在，一般较多分布在产热植物的花序中。
据报道，水稻、大麦等34种主要农作物的叶片和繁殖器官中都含有水杨酸，在不同植物及同一植物的不同组织内含有的水杨酸的含量不同，通常含量较低，在产热植物花序和受病原物侵染的植物组织中含量较高。
水杨酸是肉桂酸的衍生物，在植物体内合成，一般认为是通过莽草酸先形成肉桂酸，然后可经过两条途径生成水杨酸：
一种是肉桂酸先经过β-氧化产生苯甲酸，在经过羟化即产生水杨酸；
另一种是肉桂酸先经过羟基化产生邻香豆酸，再经β-氧化产生水杨酸。
水杨酸（SA）作为植物内源激素,它不仅能调节植物的一些生长发育过程,还对诱导植物抗性有重要作用,无论是对植物抗生物胁迫还是抗非生物胁迫中都发挥着重要作用。
SA与植物的耐热性、耐盐性、耐冷性、重金属胁迫、生物胁迫等都有很密切的关系。
2007年，高政权等通过向对数生长期的雨生红球藻中加入不同浓度的水杨酸（SA）溶液，进行胁迫培养，同样得出水杨酸和其他植物激素一样可以促使雨生红球藻合成与积累虾青素[24]。
由此可以推测脱落酸与水杨酸这两种激素也会对9号淡水小球藻的生长及细胞中油脂的合成与积累具有一定的影响。
1.4微藻油脂提取技术
微藻油脂相对动植物油脂具有积累快，含量高，周期短等特点，具有更强商业竞争优势[3]。
很多研究者已开始应用微藻油脂生产生物柴油的研究。
Mata等、Singh等人都对微藻能源开发利用进行了系统性的综述、评估与展望，并着重性的探讨了利用微藻作为生物质资源开发生产生物柴油的可行性[25,26]。
微藻作为生物质资源进行开发，其油脂的提取是关键[3]。
油脂一般不溶于水，而易溶于有机溶剂中，选择合适的有机溶剂萃取油脂是油脂提取的关键，而破碎处理能更好地从细胞体内萃取出油脂或提高油脂提取率。
理想的溶剂重要特性就是其溶解性高并且毒性较低，有时也要求具有低沸点便于溶剂挥发。
油脂提取主要选择氯仿与甲醇组合进行油脂萃取，该方法同样应用于微藻油脂提取研究[27]。
氯仿、甲醇溶剂毒性较高，对细胞具有较高损伤性。
Hara等人研究采用正己烷与异丙醇（体积比3：
2）提取油脂并与氯仿与甲醇（体积比2：
1）比较发现，提取率虽略低，但却更具优势，如具有低毒性、试剂相对廉价、便于过滤等特点。
但Sheng等人选用低毒性溶剂（乙醇、异丙醇、丁醇、正己烷以及乙酸乙酯）组合比较氯仿与甲醇组合用于微藻SynechocystisPCC6803油脂萃取研究，油脂提取率普遍较低，同时萃取物杂质较多，需进一步纯化处理，而氯仿与甲醇萃取效果较好[28]。
细胞破碎的方法有机械法与非机械法两种。
机械法作用有固相作用与液相作用，固相作用方法包括玻珠研磨法、X-press、Hughespress等；
液相作用方法包括超声波破碎、高压匀浆、微射流均质法等。
非机械法有物理法、化学法、酶法等。
物理法包括热解法、渗透压冲法等；
化学法包括酶解法、螯合剂等；
酶法包括纤维素酶破壁、自溶等[3,29,30]。
本实验中用到的萃取有机溶剂为氯仿与甲醇（氯仿：
甲醇为2：
1，现配现用），细胞破碎的方法是超声波细胞破碎法。
超声波细胞破碎法是一种适合大多数藻类细胞的破壁方法，其原理就是超声波能够对媒介质产生独特的机械振动作用和空化作用[30]。
超声波细胞破碎仪能够将电能通转化为声能，这种能量通过液体介质时会变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生像小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。
这种小气泡在微藻细胞壁附近破裂就会破坏微藻的细胞壁，使胞内物质释放出来。
裴海燕等在研究藻细胞破碎对释放有机物特性的研究中发现，超声波处理确实增加了微藻细胞内有机物的释放[31]。
孙利芹等研究了超声波对紫球藻的破碎效果，结果表明当输出功率150W、处理时间20min时，破碎率达到85%[32]。
超声波法具有破壁率高、处理时间短、对环境无污染等优点，但目前超声波处理对所提油脂品质的影响还不很清楚且很难应用到大规模生产中。
第二章实验方法
2.19号小球藻的培养
2.1.1藻种
9号淡水小球藻原藻种购自中国科学院水生生物研究所
2.1.2藻种培养
在两个5L的三角瓶中分别加入4L的液体培养基，并接种相同体积的原藻液。
培养条件：
光照强度1200Lux，光暗比12h:
12h，培养温度23℃，恒温培养，每天手动摇瓶3~5次，营养盐添加频率为每两周加一次1/4量的营养盐，最终待9号小球藻培养至对数生长期。
本实验采用BG11培养基（pH=7.1），其中各营养成分浓度如下：
（一）大量元素：
NaNO375g/LK2HPO42g/LCaCl2·
2H2O1.8g/L
Na2CO31g/L柠檬酸0.3g/LMgSO4·
7H2O3.75g/L
EDTANa250mg/L柠檬酸铁铵0.3g/L
（二）微量金属元素：
H3BO32.86g/LMnCl2·
4H2O1.86g/L
CuSO4·
5H2O80mg/LZnSO4·
7H2O0.22g/L
Co（NO3）2·
6H2O50mg/LNa2MoO4·
2H2O0.39g/L
2.2实验材料
2.2.1药品与试剂
脱落酸、水杨酸、氯仿、甲醇、95%乙醇、蒸馏水等
2.2.2仪器
烧杯、试管、量筒、容量瓶（1L）、三角瓶（300mL，5L）、离心管（10mL，50mL）、称量纸、擦镜纸、研钵、比色皿、胶头滴管、血球计数板、盖玻片、封口膜、细线、pH试纸、玻璃棒、钥匙、移液枪、棉球、镊子等。
超净工作台（DL—CJ—IN）
高压蒸汽灭菌锅
电子天平（HANGPINGFA1004）
分析天平
可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司723型）
台式低温离心机（HERAEUS）
超声波细胞破碎仪（美国SONICSVC605）
普通光学显微镜（SEC—282）
光强度测量仪
漩涡混合器（MVS—1）
电热恒温鼓风干燥器（DGF30/14—IIA）
恒温箱
氮吹仪（上海泉岛科贸有限公司QSC—12T）
2.3实验方法
2.3.1激素的配置
首先将两种激素分别配制成浓度为500mg/L的母液，配制方法如下：
用电子天平准确称量0.5g脱落酸粉于烧杯中，然后加入适量蒸馏水使之充分溶解，然后转移至1L容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗烧杯并转入容量瓶中，定容到1L，从而配制成500mg/L的脱落酸母液。
水杨酸不易溶于水，但易溶于有机溶剂，本实验利用少量的95%乙醇溶解水杨酸粉末后，再添加无菌水配置成水杨酸母液。
配制方法：
用电子天平准确称量0.5g水杨酸于烧杯中，加入少量95%乙醇充分溶解后转移至1L的容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗烧杯并转入容量瓶中，后定容至1L，从而配制成500mg/L的水杨酸母液。
2.3.29号小球藻的诱导
将培养至对数生长期的9号小球藻藻液分装至36个300mL的三角瓶中培养。
具体操作：
在超净工作台上将两个三角瓶（5L）中的小球藻藻液各分装18瓶，每瓶加入200mL的藻液并做好标记，同一大三角瓶中分装的小培养瓶标记要一样。
本实验中两种激素分别设置了不同的激素浓度，见表1。
每个培养瓶中只加入一种激素。
表19号小球藻培养液中所含激素浓度
小球藻
1
2
3
4
5
6
脱落酸
水杨酸
100μg/L
500μg/L
1mg/L
10mg/L
50mg/L
20mg/L
根据本实验设置的激素浓度，在超净工作台上分别向培养瓶中加入不同体积的激素母液，以实现不同浓度的脱落酸、水杨酸对9号淡水小球藻的诱导，并做好相应的标记，每一激素浓度设置3个平行实验。
0、100μg/L、500μg/L、1mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L激素浓度分别对应加入0、40μL、200μL、400μL、4mL、8mL、20mL的母液。
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