头孢菌素ccc 2Word文档格式.docx

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2.2.3发酵培养基....................................10

2.3培养基的灭菌.....................................10

2.3.1灭菌方法.......................................11

2.3.2培养基的湿热灭菌................................11

2.4空气灭菌.........................................11

2.4.1过滤除菌流程及设备..............................11

2.4.2无菌空气的检查..................................13

2.5发酵罐的灭菌......................................13

3种子扩大培养.....................................13

3.1种子制备.........................................13

3.2发酵罐培养.......................................13

4发酵罐的设计....................................14

4.1发酵罐的结构......................................14

4.2发酵罐的工艺尺寸...................................14

4.3封头壁厚.........................................16

4.3物料衡算.........................................16

5发酵过程的工艺控制...............................17

5.1发酵过程的补料策略.................................17

5.2发酵过程pH值的控制................................17

5.3发酵过程温度的控制.................................18

5.4溶氧的控制........................................18

5.5染菌的控制........................................18

6下游加工.........................................18

6.1发酵液的过滤和预处理...............................19

6.2提取............................................19

7总结和讨论......................................19

8头孢菌素发酵工艺总流程图.........................19

9参考资料.........................................20

引言

头孢菌素C（CephalosporinC）属β-内酰胺类抗生素，是国际上抗生素类药物之一，在抗生素药物中所占比例也逐年上升。

头孢菌素C为两性化合物，分子中有两个羧基和一个氨基，其PK值为等于2.6（侧链羧基）3.1（核羧基），9.8（侧链NH4+基）。

在甲基吡啶-醋酸盐缓冲液（pH7）和吡啶-醋酸盐（pH4.5）缓冲液中，电泳趋向于正极，表明头孢菌素C在中性和偏酸性下呈现酸性，能与碱金属结合成盐类。

头孢菌素C钠盐含有两个结晶水，为白色或淡黄色结晶性粉末，易溶于水，

不溶于有机溶剂。

对稀酸以及重金属离子均稳定，当pH大于11时迅速失活。

同时失去在260nm下的吸收峰，紫外光照射也可失活。

对葡萄球菌产生的青霉素酶稳定，但易被某些革兰氏阴性菌产生的头孢菌素酶水解。

头孢菌素C对茚三酮、双缩脲反应呈阳性，对亚硝基铁氰化钠反应呈阴性，紫外最大吸收为260nm。

头孢菌素C中最富有反应性的基团是3-乙酰氧基。

温和条件下用酸水解头孢

菌素C可得到少量除去侧链的母核―7-氨基头孢烷酸简称7-ACA。

经酸水解或乙酰酯酶处理头孢菌素C，则生成去乙酰头孢菌素，简称DCPC。

其为头孢菌素C发酵液中的主要副产物，理化性质与头孢菌素C及其相似。

其PK值等于2.5、3.0、9.7。

紫外最大吸收波长为261nm；

红外光谱与头孢菌素C相似。

头孢菌素C及其它头孢菌素在弱碱性条件下发生水解、胺解等反应，或在酶催化水解时不能生成类似于青霉噻唑基那样稳定的头孢噻唑基，因为反应不仅打开β-内酰胺环，而且还进一步使二氢噻嗪环也破裂，最终形成以侧链为主的派那地酸或派那地酸结构的衍生物。

头孢菌素C抗菌活性及临床应用，头孢菌素类抗生素自1970年以来是国外发展最迅速，上市品种最多的一类抗生素，是包括头孢烯、氧头孢烯、碳头孢烯和7α-甲氧基头孢烯在内的一类药物。

它们的作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，而人类和其他哺乳动物的细胞无细胞壁，因此对人应是无害的。

临床应用证明它是一类抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、毒性低的抗生素，为人类战胜各种细菌感染作出极大的贡献。

国内从1980年开始至今进行了两轮较大规模的开发研究，引进消化提高，至此已达到一定水准。

主要由于其抗菌谱广，杀菌力强，对β-内酰胺酶稳定性高，毒副反应低，临床疗效好。

同时具有较高商业利润。

故国外众多制药公司、研究部门相继投入巨资，从事开发和生产，取得了许多令人瞩目的成果。

而我国20世纪末头孢菌素工业才有长足发展。

对头孢菌素的广泛而深入的研究，改造后的衍生化合物作为化疗剂有的已突破了抗细菌感染的范围，具有蛋白酶抑制剂的功效，可用于抗退化、治疗癌症、骨质疏松、类风湿关节炎、阿尔茨海默病、白内障等。

这很可能为头孢菌素带来新的前景。

头孢菌素的发展速度、临床使用率和销售利润大大超过半合成青霉素，从而引起国内外制药行业高度重视。

自发现头孢菌素C以来，将近半个多世纪实验研究，使生产工艺不断完善，头孢菌素C发酵单位目前已突破40000u／ml以上（均按CPC游离酸计算，以HPLC测定）。

发酵罐规模均在100m3以上。

同时也筛选出不加蛋氨酸的头孢菌素C菌种，并摸索出最佳发酵温度、培养pH及搅拌转速，以最大限度减少DCPC（脱乙酰头孢菌素）含量。

因为过多DCPC不仅会影响CPC的提取收率与质量，而且也给以后CPC的化学裂解收率或酶法裂解收率及7－ACA纯度带来不良影响。

提取方法大都采用大孔吸附剂-离子吸附树脂-锌盐沉淀工艺路线所取代。

一般提取总收率（自发酵液计算）约75％左右。

目前多采用超滤工艺，进一步提高了滤液质量，从而把提取总收率提高到78％～80％左右。

目前国内所有生产7－ACA厂家都已采用此项工艺路线，收率高，对后工序有利。

目前化学裂解法对环境污染大，残污液处理费用较昂贵。

自1970年以来，英国、日本、荷兰等国相继研发酶法产生7－ACA、7－ADCA工艺。

国内随着对环保重视程度的提高，近几年部分药厂已实施了酶法7－ACA的规模化生产。

虽然头孢菌素的前景广阔，但是由于国内外抗生素企业头孢原料药项目的竞相上马，头孢产品已经出现过热现象。

目前国际上有意大利、韩国、日本等头孢原料厂商，国内有石家庄制药集团、福州抗生素厂、哈尔滨制药集团、山东抗生素厂、山西威奇达、齐鲁药业等厂家，近几年头孢菌素原料药已经出现像青霉素一样的世界大战，提高技术指标、降低成本成为各个企业的唯一出路。

目前，头孢菌素C的发酵大致划分为两种类型：

一种是低菌浓、短周期、低单位、高质量发酵液、高收率的发酵类型；

二是高菌浓、长周期、高单位、收率相对略低的发酵类型。

目前国内厂家多采用前一种发酵类型，周期120-140h，放罐菌浓45-52%；

而国外大多数厂家，如韩国、意大利等多采用后一种发酵类型，周期160-170h，放罐菌浓60-65%。

1菌种的选育

1.1菌种的选育及制备

1.1.1实验材料

●菌株：

CephalosporiumacremoniumHB-2，石药集团河北中润制药提供。

●试剂：

培养基用试剂为市售分析纯及生化试剂。

蛋氨酸、蛋白胨，上海生化试剂厂。

无机盐：

MgSO4·

7H2O，FeSO4·

7H2O，ZnSO4·

7H2O，MnSO4·

H2O，

●CuSO4·

7H2O，（NH4）2SO4，KH2PO4，北京奥博星生物技术有限公司。

●仪器设备：

安捷仑HPLC1100s高效液相色谱仪；

雷兹LDZ5－2离心机，北京医用离心机厂；

麦克奥迪B5professionalseries显微镜；

SPY-50双层摇床，上海离心机械研究所；

NDJ－1旋转式黏度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.1.2培养基的配置

●深冷管保护液（ml/2ml）：

甘油1.0，脱脂乳1.0。

●斜面、分离培养基（g/L）：

麦芽糖60，酵母粉20，蛋白胨10，琼脂20，

●自来水配制，pH7.0～7.2。

●种子培养基（g/L）：

葡萄糖5，蔗糖6，玉米浆20，谷朊粉15，硫酸铵10，D/L蛋氨酸5，CaCO35，自来水配制，pH6.2～6.4。

●发酵培养基（g/L）：

葡萄糖10，淀粉30，糊精60，玉米浆50，谷朊粉12，α-淀粉酶0.2，MgSO4·

7H2O1.0，FeSO4·

7H2O0.2，ZnSO4·

7H2O0.01MnSO4·

H2O0.01，CuSO4·

7H2O0.02，（NH4）2SO410，KH2PO45，蛋氨酸6，轻质CaCO35，豆油50，自来水配制，pH6.0～6.2。

1.1.3菌种选育方法

1.1.3.1自然选育

●单菌落分离：

将出发菌株采用10倍稀释法稀释，取10-4～10-6倍涂平皿，每皿滴加2～5滴，用三角耙把菌液涂匀。

单菌落于28℃培养14～18天，第三天倒置培养。

每天观察生长情况，待菌落生长饱满，即可传斜面。

●斜面种子制备：

取无菌小试管数只放在试管架上，各加1ml菌水。

用竹铲铲下选好的单菌落，分别放入小试管，搅匀。

用吸管吸取菌液接入试管斜面，涂布均匀。

每个单菌落对应一个斜面，标明相应编号，斜面放28℃培养间培养，定期观察。

长好的试管斜面加入等体积的保护液制作深冷管保藏，备用。

●生产能力验证：

取试管斜面，加无菌水5-10ml，吸取0.5ml菌液接种250ml种子摇瓶（内装25ml种子培养基）。

种子摇瓶于28℃、180r/min摇床培养96h。

●吸取4.0ml种子液接种500ml发酵摇瓶（内装50ml发酵培养基）。

发酵摇瓶于28℃、200r/min摇床培养48h后移至25℃恒温室，200r/min摇床培养至放瓶。

放瓶检测pH、PCV、滤速、头孢菌素C效价、杂质含量。

选取放瓶效价较高的菌株，经过中试发酵设备一、二级种子罐扩大培养后接种发酵罐，确定菌株生产能力。

一级种子在通气比1：

0.8、温度28℃条件下培养96小时后移种至二级种子罐，接种量11%。

二级种子罐在相同条件下培养40小时移种至发酵罐，接种量15%。

发酵罐0~50小时28℃、通气比1：

1.2，51~144小时25℃、通气比1：

1.5。

发酵过程中补油、硫铵、氨水，并保证溶氧不小于20%、氨氮不低于0.5g/ml。

1.1.3.2头孢菌素C抗性平皿的制备

将灭菌后的固体分离培养基放凉至50℃左右，加入头孢菌素C溶液，使最终头孢菌素C的浓度为5g·

L-1，混匀后吸取10ml加入到无菌平皿中，平皿呈15o角摆放，自然冷却待凝固后，将平皿放平。

另取一瓶灭菌后并放凉至50℃左右的固体分离培养基，取出10ml加入上述已凝固的平皿中，水平摆放，自然冷却备用。

1.1.3.3紫外线诱变

●菌悬液的制备：

选择培养好的斜面，加入10ml无菌水，用吸管将孢子轻轻刮下后吸出，用研磨器将菌悬液研磨，得到单细胞菌悬液。

用血球计数板计算孢子数在20-30亿个ml-1。

●菌悬液的预培养：

取10ml研磨后的菌悬液接入装量为25ml的液态斜面培养基中预培养2h。

●紫外诱变：

将预培养的单细胞菌悬液加入平皿中，每皿1ml，用磁力搅拌器缓慢搅拌菌悬液，在红外光下操作，用30W紫外灯管，距离25cm，照射30sec—5min。

在照射受试菌前，灯管须预热20min。

照射后平皿用黑布包严，防止发生可见光的修复作用。

●培养：

用吸管吸取诱变后的孢子悬液，稀释10-1～10-3倍涂布头孢菌素C性平皿，用三角耙把菌液涂匀。

单菌落于28℃培养14～18天，第二天倒置培养。

●筛选：

每天观察生长情况，待菌落生长饱满，挑选高头孢菌素C浓度区的单菌落即可传斜面。

1.2菌种的保藏

菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。

其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。

一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。

常用的菌种宝藏方法有：

斜面冰箱宝藏法、沙土管宝藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。

在这里我们采用斜面冰箱宝藏法中的甘油冷冻管保存法。

甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般可保存2年。

①将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面，经28℃24～48h培养后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，移至预先装有无菌蒸馏水的试管中，调整菌液浓度，使其等同于1单位麦氏比浊管。

②向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。

③轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装于无菌小试管中，在-30℃条件下贮存。

2培养基的配制

2.1培养基的营养要求

培养基的成分大致分为碳源、氮源、无机盐、微量元素、特殊生长因子、促进剂、前体和水等几大类。

对不同的微生物，微生物不同的生长阶段，不同的发酵产物以及不同发酵工艺条件等，所使用的培养基都是不同的，这些也都是培养基配制需要考虑的因素。

2.1.1水

水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。

水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。

2.1.2碳源

碳源的主要为微生物细胞的生长繁殖提供能源。

目前生产中性淀粉酶的菌种为异养型微生物，所以只能利用有机碳；

大量的农副产品是主要的有机碳源，如山芋、麸皮、玉米粉、米糠、马铃薯、木薯、土茯苓等淀粉质原料，这里用到的碳源是玉米粉（淀粉含量90%）。

2.1.3氮源

氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素，酶自身即为蛋白质。

因此，氮源是必不可少的重要原料。

常用的有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。

我们用到的氮源是琼脂，谷朊粉（含蛋白质86%）和蛋白胨。

常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。

2.1.4无机盐类及微量元素

酶在生长和繁殖生长过程中，需要某些无机盐及微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、锌等。

钠离子具有控制细胞和培养基之间的渗透压的作用，从而促进产酶，添加适量亚硝酸钠可提高酶活力；

钙对淀粉酶有稳定和活化作用。

2.1.5生长因子和产酶促进剂

酶的生产中所需的生长因子大多由天然原料提供。

玉米浆、麦芽汁、豆芽汁等，都含有丰富的生长因子。

产酶促进剂一般是该酶的底物和底物类似物。

2.2培养基的种类

培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。

微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。

2.2.1孢子培养基

孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。

对孢子培养基的要求：

①营养不要太丰富；

②所用无机盐的浓度要适量；

③注意培养基的pH和湿度。

斜面、分离培养基（g/L）：

麦芽糖60，酵母粉20，蛋白胨10，琼脂20，自来水配制，pH7.0～7.2。

2.2.2种子培养基

种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。

对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。

头孢菌素c的种子培养基的配比为（g/L）：

玉米粉90，谷朊粉22，硫酸铵10，轻质CaCO5，α-淀粉酶1。

培养基配后pH为6.4～6.6。

2.2.3发酵培养基

发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。

头孢菌素c的发酵培养基配比为（g/L）：

玉米粉100，谷朊粉90，α-淀粉酶1，MgSO·

7HO3，KHPO5，（NH）SO430，微量元素10，轻质CaCO35。

其中微量元素：

ZnSO·

7HO0.01，MnSO4.H2O0.01,CuSO4·

7H2O0.02，FeSO4·

7H2O0.2。

2.3培养基的灭菌

生物化学反应过程中，特别是细胞培养过程，往往要求在没有杂菌污染的情况下进行，这是由于生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，因而很容易受到杂菌污染，进而产生各种不良后果：

●由于杂菌的污染，使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率下降；

●由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降；

●污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；

●污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化；

●发生噬菌体污染，微生物细胞被破裂而使生产失败等。

2.3.1灭菌方法

所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。

常用的灭菌方法有：

化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭菌等。

本实验采用湿热灭菌。

2.3.2培养基的湿热灭菌

湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌，是工业中最重要的灭菌方法。

在同样的温度下，温热的杀菌效果比干热好，其原因有：

①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。

湿热灭菌中菌体蛋白质吸收水分，较同一温度的干热空气中易于凝固而杀灭各种微生物。

②温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高温度。

因而湿热灭菌比干热所要温度低。

如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。

③湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。

影响灭菌效果的因素

⑴微生物的种类和数量；

⑵培养基性质、浓度、成分；

⑶灭菌的温度、时间。

热阻：

微生物对热的阻抗能力。

灭菌原理：

对数残留定律，经加工灭菌，死亡微生物速度和存在的微生物数量成正比。

v本次条件为在121℃（表压约0.1MPa）维持30分钟。

2.4空气灭菌

此课题为好氧发酵，以空气作为氧源。

根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。

获得无菌空气的方法有：

辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。

过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，其介质有棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、金属烧结管等。

2.4.1过滤除菌流程及设备

流程如下：

采风塔→空气粗过滤器→空气压缩机→储气罐→冷却器→旋风分离器→冷却器→丝网除沫器→空气加热器→总空气过滤器。

设备如下：

采风塔：

采风塔建在工厂的上风头，高至少10m,气流速度8m/s。

粗过滤器：

主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。

空气压缩机：

作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。

空气储罐：

作用是消除压缩空气的脉动。

要求：

H/B=2～2.5V=（0.1～0.2）V1

其中，H为罐高；

B为罐直径；

V1为空压机每分钟排气量（20℃，1×

105Pa状况下）。

旋风分离器：

是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。

作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。