检测两种蛋白质之间相互作用Word下载.docx

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可以别离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体.缺点：

免疫共沉淀同样不克不及包管沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白.另外灵敏度不如亲和色谱高.

●Far-Western

又叫做亲和印记.将PAGE胶上别离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标识表记标帜了同位素的诱饵蛋鹤产生作用,最后显影.缺点是转膜前需要将蛋白复性.

2.等离子概略共振技术（Surfaceplasmonresonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖概略,葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜概略.当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋鹤产生相互作用,那么两者的结合将使金属膜概略的折射率上升,从而导致共振角度的改动.而共振角度的改动与该处的蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间的相互作用.该技术不需要标识表记标帜物和染料,平安灵敏快速,还可定量阐发.缺点：

需要专门的等离子概略共振检测仪器.

3.双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成.辨别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白,在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以产生相互作用,则可使结合域和激活域在空间上充分接近,从而激活陈述基因.缺点：

自身有转录功效的蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功效.晦气于核外蛋白研究,会导致假隐性.

5.荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<

100埃）时,它们之间可产生能量转移的现象.荧光共振能量转移技术可以研究份子内部对某些刺激产生的构象变更,也能研究份子间的相互作用.它可以在活体中检测,很是灵敏,辩白率高,能够检测大份子的构象变更,能够定性定量的检测相互作用的强度.缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃.另外设备昂贵,还需要融合GFP给蛋白标识表记标帜.

此外还有交联技术（cross－linKing）,蛋白质探针技术,噬菌体展示技术（Phagedisplay）以及生物信息学的办法来检测蛋白质之间相互作用.

1，酵母双杂交1-5

酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因辨别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因,构建成融合表达载体,从表达产品阐发两种蛋白质相互作用的系统

酵母双杂交的原理是,把陈述基因HIS3和lacZ整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子

GAL4的调控表达.一旦GAL4蛋白结合到HIS3和lacZ调控序列相应的位点,则启动陈述基

因的表达.通过检测陈述基因的表达判断阳性或阴性.实际应用中,把GAL4基因分红两个部

分：

DNA结合区（gal4DNAbindingdomain,GBD）和激活区（gal4activatingdomain,GAD）.分

别把GBD和GAD构建到两个不合的载体上,并能表达相应的两个融合蛋白（GBD-X和

GAD-Y）.然后把GBD-X和GAD-Y两种载体共转染到带有陈述基因的酵母细胞中.当GBD-X

融合蛋白中X蛋白与GAD-Y融合蛋白中Y蛋鹤产生相互作用时（或结合在一起时）,就使得

原天职开的GBD和GAD蛋白靠近并具有完整的GAL4蛋白的功效,从而能够激活陈述基因的

表达.

（1）筛选相互作用的蛋白

酵母双杂交技术能用于对cDNA文库的筛选.把你要研究的蛋白亚克隆到GBD载体上,

作为“诱饵”蛋白.把文库蛋白基因亚克隆到GAD载体上.然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用的蛋白.也许你能够筛选到多株阳性克隆.虽然酵母双杂交技术具有广泛的应用价值,但正如任何其它技术一样,酵母双杂交技术也有一定的局限性.酵母双杂交技术最大的弱点就是假阳性出现率.所以筛选到的阳性克隆需要进一步的鉴定和功效数据支持.

（2）确定介入结合作用的结构域或motif

当你确定了两个蛋白质份子之间有相互作用后,利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质份子中那些结构起结合调节作用.你可以先把一个蛋白进行随机缺失,制备一系列缺失体,然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力的大小,直到发明在蛋白质两两份子间起决定作用的氨基酸序列（称为结构域或motif）.如果一个蛋白份子中具有已知的结构域或motif,也一样进行缺失,看是否这些已知的结构域或motif介入结合调节作用.有的情况下蛋白质相互作用可能与蛋白质的磷酸化状态有关.这时就需要对可能的磷酸化位点进行点突变,检测这些磷酸化位点是否介入调节蛋白质的结合作用.

2,GST沉淀实验（GST-pulldown实验）（细胞外蛋白质相互作用）5-11

上面提到,用酵母双杂交办法筛选到的蛋白需要作进一步的鉴定.鉴定办法之一就是GST沉淀实验.GST沉淀实验主要是用来证明蛋白质胞外的相互作用.蛋白质在胞外的相互作用排除了酵母细胞内庞杂体系的搅扰,,比较直接地检验蛋白质份子之间存在的物理的相互作用.同酵母双杂交实验一样,运用此法也可以证明相互作用的蛋白份子中是否有介入调节作用的结构域或motif.GST沉淀实验原理就是,把你要研究的蛋白基因亚克隆到带有GST（谷胱甘肽转移酶）基因的原核表达载体中,并在细菌中表达GST融合蛋白（GST-X）.把GST融合蛋白挂到带有GST地物的Sepharosebeads上,然后把另一种蛋（Y）白加入其中.由于蛋白质之间的结合作用,形成了这样的复合物：

GST-X----Y.这一复合物与固体支持物（Sepharosebeads）又结合在一起,可以被沉淀下来.此法又有在不合情况下的具体应用,以下一一作介绍.

（1）GST融合蛋白与重组蛋白的相互作用

GST融合蛋白是在原核表达的,所以没有经过过多的象真核细胞内具有的蛋白修饰作用.所以另一种用来检验相互作用的蛋白也可以用原核表达出来,也就是所谓的重组蛋白.当GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来,然后用重组蛋白的抗体作Westernblotting检测.

（2）GST融合蛋白与体外TNT系统合成的多肽或蛋白的相互作用

用来检验与GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT体外蛋白合成体系进行合成,并且还可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便于检测的标签.GST融合蛋白沉淀下来的蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽的抗体或标签抗体进行Westernblotting检测.如果蛋白之间结合力很是弱,用Westernblotting检测办法难以检测到,你可以在TNT体外合成时给蛋白进行同位素（S32）标识表记标帜.这样沉淀下来的蛋白进行放射自显影,检测灵敏度将极大提高.

（3）GST融合蛋白与细胞内源性蛋白质的相互作用

GST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用的内源性蛋白质沉淀下来.如果内源性蛋92白含量低或结合力弱,可以采取脉冲法使细胞在某一段时间内合成的所有蛋白都标识表记标帜上放射性同位素（S32）,然后提取细胞总蛋白与GST融合蛋白温育.GST融合蛋白沉淀下的带有放射性标识表记标帜的蛋白跑电泳,进行放射自显影.

（4）GST融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的相互作用

当内源性蛋白质含量低,并且有可能影响蛋白质的相互作用,也可以把该蛋白的基因转染到靶细胞内进行过表达,然后检验蛋白质相互作用.

（5）GST融合蛋白与待测蛋白的相互作用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关

在进行GST沉淀实验时,有时也会遇到比较庞杂的情况,具体情况具体阐发,辨别对待.比方,两个蛋白质之间产生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关.或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用,或者磷酸化的蛋白必须脱磷酸化后才干产生相互作用.如果你确实在你的实验中发明了其中一种情况,这将是一个很是有意义的结果.

3,免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）（细胞内蛋白质相互作用）9-16

免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内是否有相互作用.一般来说,两种蛋白在细胞内产生相互作用时会形成两种蛋白的复合物,这样就可以先用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白的抗体进行Westernblotting检测,看两种蛋白之间是否确实形成免疫复合物,并能与proteinA/Gagarose一起沉淀下来.免疫共沉淀原理简单,但技术极为庞杂.因为细胞内蛋白种类单一,制约因素多.如果两种蛋白之间可以产生相互作用,其实不是这两种蛋白所有份子都介入结合作用,也可能只有极少部分蛋白份子结合在一起（足以满足细胞功效需要）.在提取细胞蛋白时,如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成的复合物的稳定性使得免疫共沉淀实验失败.如果两种蛋白在细胞内的结合力确实很是弱,那么免疫共沉淀也难以成功.如果知道产生相互作用的两个蛋白都是胞核蛋白,那么可以通过提取核蛋白,再进行免疫共沉淀实验,这样会大大减低布景的搅扰.关于两种蛋白质之间胞内的相互作用,有时确实无法用免疫共沉淀实验证明.

（1）细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀

证明蛋白质胞内相互作用时,可以选择一个高效瞬时过表达系统（至于这一系统是否有内源性靶蛋白无关紧要）.一般采纳COS细胞作为真核表达株.把两种蛋白基因共转染到COS细胞内进行表达.由于人为进行大量表达,所以在胞内两种蛋白形成相互作用的复合物的量也相应增多.如果你手头没有这两种蛋白的抗体,可以把这两种蛋白的一端辨别加上标签以融合蛋白形式表达,然后用商业化的抗标签抗体进行免疫共沉淀和Westernblotting检测.

（2）细胞内源性蛋白的免疫共沉淀

把两种蛋白共转染到COS细胞内进行过表达,进行免疫共沉淀实验,相对容易成功,但是这一结果究竟具有人工性,不克不及代表生理条件下真实的蛋白质相互作用.要想克服这一弱点,可以做内源性的免疫共沉淀实验.这一技术要求极高,难度极大,但也最有说服力.因为细胞内内源性蛋白含量低,结合在一起形成复合物的量更低,难以检测.首先要证明所选择的细胞93系是否具有这两种内源性的蛋白.另外,用于免疫沉淀和Westernblotting检测的体要好.细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温和,以坚持蛋白复合物的天然结构.

（3）组织内蛋白的免疫共沉淀

在体外可以大量培养细胞,然后制备细胞提取物,做内源性免疫共沉淀.由此可以推广到做组织内免疫共沉淀.取动物组织（脑、肝、脾等）,切碎,匀浆,提取组织蛋白,进行免疫共沉淀实验.这一结果代表活体中蛋白质相互作用.

4,蛋白质细胞内定位实验17-22

另一种经经常使用来检验蛋白质相互作用的办法是蛋白质细胞内定位技术.此法较为直不雅,可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的散布（膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等）.有时相互作用的蛋白由于细胞内某种功效的需要结合在一起时,使得两种蛋白的散布产生变更.比方,某种蛋白也许在核内,当它与另一种具有穿梭功效的蛋白结合时,有可能被转运到胞浆中.这种情况的共定位则较为典型.在进行蛋白质共定位

（1）利用有色荧光蛋白标识表记标帜技术进行蛋白定位研究

此法也可称为活细胞定位.把两种具有相互作用的蛋白辨别克隆到带有两种不合颜色荧光荧光显微镜直接不雅测.在进行精确细胞定位或共定位时,必须用共聚焦荧光显微镜不雅测.因为

共聚焦荧光显微镜（相当于医院给病人诊断的CT）不雅测的是细胞内一个切面上的颜色.如果在

一个切面上在同一区域看到两种颜色,就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用.普通荧光显

微镜看到的是一个立体图象,无法确定蛋白质共定位现象.在进行定位或共定位同时,也可以

对细胞核进行染色.这样,在细胞中就有三种颜色.细胞核的显色帮忙你确定共定位产生的位

置.

上面介绍的活细胞定位,其优点是表达的荧光蛋白荧光强,没有布景,不雅测便利.但缺点

是相互作用的蛋白由于标上荧光蛋白,实际上是两个融合蛋白.融合蛋白的定位结果或共定位

结果是否与天然蛋白散布一致,有待于进一步确定.而利用免疫荧光标识表记标帜技术可以避免这一缺

点.

（2）利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研究

免疫荧光的原理是,首先把细胞进行固定,然后用待检测靶蛋白的抗体（一抗）与细胞内

靶蛋白进行免疫反响,再用荧光素（如FITC和TRITC等）标识表记标帜的二抗与一抗进行反响.这样

就在细胞内形成免疫复合物（靶蛋白----一抗---二抗）,结果靶蛋白被标上颜色,然后可用共聚

焦荧光显微镜不雅测定位与共定位结果.

免疫荧光技术最大优点就是可用来检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用.当然也可以对

靶细胞进行转染表达目的蛋白,然后标识表记标帜目的蛋白进行不雅测.免疫荧光技术的缺点是荧光相对

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较弱并且布景较高,结果受到搅扰,所以这项技术欠好掌握.为了结果的可靠性,要求严格设