实验三果酒酵母的分离文档格式.docx
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147.32
145.94
6.56
菌种3
158.4
156.73
154.78
152.99
152.1
151.24
150.04
8.36
菌种4
155.1
153.97
152.04
150.34
149.42
148.66
147.7
7.4
菌种5
156.1
155.22
152.86
151.02
149.95
149.28
148.15
7.95
从上表能够看出1号菌株在发酵终了时CO2开释量(g)最多,即1号菌株发酵速度最快,是发酵速度较高的酵母。
不同发酵时刻(d)CO2开释量/g
1
2
3
4
5
6
0.98
2.31
2.08
1.19
0.99
1.76
0.67
1.47
1.04
1.02
1.38
1.67
1.95
1.79
0.89
0.86
1.2
1.13
1.93
1.7
0.92
0.76
0.96
0.88
2.36
1.84
1.07
从上表能够看出1号和5号菌株在发酵开始时CO2开释量(g)最快,即1号和5号菌株发酵力最强。
3.耐受性试验
做1号菌株和5号菌株的耐受性试验:
采纳杜氏管发酵法测定所选择的酵母菌对乙醇(5%、6%、7%、8%、9%)二氧化硫(30、50、60、90、120mg/L)的耐性。
1号菌株
酒精量(%)
7
8
9
杜氏小管产气情形
充满小管
半管
小气泡
无气体
二氧化硫浓度(mg/L)
30
50
60
90
120
5号菌株
从上表能够看出1号和5号菌株对二氧化硫耐受力差不多相同,5号菌株对酒精耐受力比1号菌株强。
果酒是利用新奇水果为原料,在储存水果原有营养成分的情形下,利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。
果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分,还含有丰富的生理活性物质,经常适量饮用具有一定的保健作用。
酵母品种是酿造果酒的关键因素之一,酵母性状的好坏直截了当阻碍到所酿果酒的口感和风味,决定果酒品质的优劣。
果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母,前者的应用提高了果酒酿造的生产效率,后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的阻碍。
野生型果酒酵母经分离纯化后,结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术,其酿造性能显著提高,酿造的果酒品质明显改善,因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。
本实验选用当季新奇水果为原料,分离纯化3-5株酵母菌,并对其选择使其适合果酒酿造。
一、实验目的和内容1.学习把握果酒酵母分离纯化的方法;
2.对分离纯化得到的酵母菌进行选择使其适合果酒酿造。
二、实验原理
酿酒酵母细胞透亮,呈圆形或椭圆形,形体比较大,一样为7×
12μm,含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。
优良纯种酵母应具备下列性能:
(1)除酿酒水果本身的果香外,酵母也应产生良好的果香与酒香。
(2)生长速度快,有较高的发酵能力,能将糖分全部发酵完。
(3)具有较高的抗S02能力,有较好的凝集力和较快的沉降速度。
(4)培养基成分简单,来源广泛,价格低廉,对温度,pH,离子强度,溶氧等环境因素不敏锐。
(5)能在低温或果酒适宜温度下发酵,以保持果香和新奇清新的口味。
由此可见,酵母的品质对果酒的产量和质量阻碍专门大。
要获得优良的酿酒酵母,必须对其进行分离选育。
果酒酵母的选择应从相应的果品及其种植环境中采样分离,如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。
依照实践体会,在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高,因为它们的基质环境与酿酒环境专门相似。
为使我们需要的酵母易于检出,应对采集的样品进行富集培养,通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH等手段抑制不需要的微生物的生长,使期望检出的微生物得到增殖。
酵母检出后,应对其的发酵性能进行考察,包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等,这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。
三、实验仪器与材料
样品:
苹果
YEPD培养基(富集培养基):
蛋白胨20g,葡萄糖20g,酵母膏10g,蒸馏水定容至1000ml.
PDA培养基(酿酒酵母培养基):
马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馏水定容至1000ml.(马铃薯去皮,切成块煮沸后再煮30分钟,然后用纱布过滤,再加糖及琼脂溶化后定容至1000ml。
121℃灭菌30分钟。
)
器具:
三角烧瓶(250mL)、无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精灯、冰箱、玻璃涂棒,血细胞计数板,显微镜,磁力搅拌器,台式离心机,震荡混合器等。
四、实验方法与步骤
酵母菌在自然界中存在的范畴专门广泛,能够从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。
在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富,可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。
(1).酵母菌的分离初筛
1)菌种采样
样品
土壤
叶片
果实(带柄)
腐果
瓜根际土壤
藤下方土壤
垄间隙土壤
采集
方法
用无菌小铲清去表层石块露出土壤后,戴好无菌手套取500g左右的土样装入无菌袋内。
用无菌剪刀剪取不同生长时期的叶片装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取不同龄期的甜瓜(幼龄期,膨大期,成熟期)分别装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取腐烂的果实装入无菌袋内。
随机选择三块样地采样,每样采三份,将采集到的样品迅速储存在低温箱内(冰块降温)。
2)富集培养与纯种分离
方法一:
配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却,然后分别取适量样品(土样1g,果皮5g,果柄若干,叶片若干)各三份接种,120r/min,28℃摇床培养4天。
将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上,每个样品接三个平板,28℃恒温培养。
待菌种长出小菌落,镜检为酵母菌后,将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。
待再次长出单菌落后,挑取划线于PDA培养基上,28℃恒温培养。
菌种划线三到四次后差不多纯化。
方法二:
将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养。
腐果表面长有白色菌落,镜检为酵母菌后,用接种环将其划线至PDA培养基上,28℃恒温培养。
待长出单菌落后,挑取划线于PDA培养基上,28℃恒温培养。
(2).酵母菌种的复筛
选择果酒生产中生产性能优良的新奇果汁液作为复筛培养基。
将初选菌种接入保藏培养基。
培养24h后每支斜面接入三角瓶培养,置于23-25℃的培养箱中培养,测定其发酵水平及产香水平,选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。
发酵力试验:
采纳CO2失重法,取100mL三角瓶(差不多烘干、称重),各加入80mL果汁,置于80℃的水浴杀菌5min,冷却到30℃后,按每升接种30mL的比例分别接入酵母种子液,在20℃下发酵。
发酵过程中每24h测定1次CO2缺失量,每次测定时,摇动瓶子,以排出CO2。
随着发酵时刻的连续,瓶重逐步减轻,直到减轻量不高于0.2g,即表示发酵终止,以CO2失重量为纵坐标,发酵时刻为横坐标,绘制发酵力曲线,并确定菌株发酵力的强弱。
(3).酵母菌的耐受性试验
采纳杜氏管发酵法测定所选择的酵母菌对乙醇(8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%)、二氧化硫(60、80、100、120、140、160、180、200mg/L)的耐性。
将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中,在相同条件下培养,观看杜氏管中气泡产生情形,重复3次。
活化条件:
28℃条件下,将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h
发酵条件:
28℃条件下,水果原汁培养基中静止发酵4d;
接种量:
1×
107cfu/mL。
1)耐酒精度试验
采纳先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml,再以水果原汁为培养基,制成含酒精量为10%、12%、14%、16%、18%系列的液体培养基。
按下表在试管中加入果汁。
然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁,塞好棉塞,115℃20min灭菌。
灭菌完后,待试管温度为常温后按下表加入酒精,加完后摇匀。
最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×
107个,28℃静止培养。
观看产气情形,选出耐酒度比较好的菌种。
将标签贴于各试管上,标10、12、14、16、18,按下表每管加入果汁量:
试管编号
10
12
14
16
18
20
95%酒精/mL
1.05
1.26
1.4
1.68
1.90
2.15
果汁/mL
8.95
8.74
8.60
8.32
8.10
7.85
培养液含酒精%(v/v)
2)耐SO2试验
按亚硫酸含量为6%计,运算出60、100、120、180、240mg/L浓度所需的量,分别加入到果汁中制成SO2不同浓度系列的液体培养基。
按下表加入果汁,然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁,塞好棉塞,115℃20min灭菌。
灭菌完后,待试管温度常温后按上表加亚硫酸(科密欧试剂SO2含量≥6%),加完后摇匀。
最后在每发酵管中接入对数期酵母1×
观看产气情形,选出耐SO2比较好的菌种。
将标签贴于各试管上,标1、2、3、4、5,按下表每管加入果汁量:
亚硫酸/uL
17
40
培养液含SO2mg/L
100
180
240
五、技术指标
1.富集培养:
指从微生物混合群开始,对特定种的数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法
富集培养基:
富集培养所采纳的培养基为富集培养基
富集培养基的作用:
使混合微生物中的特定种的数量比例不断增高,并引向纯培养。
2.酵母菌镜检:
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物,其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍。
因此,不必染色即可用显微镜观看其形状。
3.血球计数板的使用
以计数酵母菌为例
(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.
(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一样稀释10倍即可.
(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央计数室上加盖专用的厚玻片.
(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液慢慢渗入,余外的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.
(5)计数时,假如使用16格×
25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.假如规格为25格×
16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.
(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一样只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).
(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式运算每1ml菌液中
运算公式
(1)16格×
25格的血球计数板运算公式:
酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×
400×
104×
稀释倍数
(2)25格x16格的血球计数板运算公式:
酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×
六、实验时刻进程表
1.3月11日10:
00-12:
00
配制YEPD培养基(富集培养基),配制PAD培养基(酿酒酵母培养基)
将买来的苹果削皮,把果皮放到研钵捣碎,等待接种用
2.3月11日16:
00-18:
将配制好的YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却,然后分别取适果皮各三份接种,120r/min,28℃摇床培养4天
将PDA培养基灭菌,倒平板
将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养
3.3月14日16:
4.3月16日14:
00-17:
第一次纯化:
挑取单个菌落镜检为酵母菌后,用接种环将其划线至PDA培养基上,28℃恒温培养
将PDA培养基灭菌,倒平板待用
5.3月18日10:
第二次纯化
配制PDA培养基,PYG培养基(菌种保藏培养基)
6.3月18日16:
培养基、培养皿、试管灭菌
PDA培养基倒平板,PYG培养基倒斜面待用
7.3月19日10:
观看酵母菌生长状况,镜检看是否已纯化
第三次纯化
8.3月20日10:
00-10:
观看平板上是否长菌,未长出
9.3月21日14:
00-14:
观看平板上是否长菌,未长出,老师建议改日再来看,可能是培养基有问题
10.3月22日14:
00-15:
第四次纯化
镜检无杂菌的接种倒斜面上,保藏菌种2株
11.3月23日14:
00-16:
镜检无杂菌的接种倒斜面上,保藏菌种3株
开始进行复筛前预备
12.3月25日10:
制作酵母种子液:
将配制好的YEPD培养基分装于5个100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却,然后将斜面上的5株菌分别接种到三角瓶中,120r/min,28℃摇床培养2天
13.3月27日14:
00-19:
稀释酵母种子液为2.67×
108个/ml
配制PAD培养基(发酵培养基),分装于5个100ml三角瓶内每瓶80ml高温灭菌冷却,然后,将酵母种子液(2ml)对应接种到发酵培养基,称重,28℃恒温培养。
酵母菌的耐受性试验:
采纳杜氏管发酵法测定所选择的酵母菌对乙醇(5%、6%、7%、8%、9%)二氧化硫(30、60、60、90、120mg/L)的耐性。
将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的PDA培养基中,在相同条件下培养,观看杜氏管中气泡产生情形
14.3月28日14:
称取发酵培养基的重量,记录数据
观看酵母菌的耐受性试验现象
15.3月29日14:
16.3月30日14:
17.3月31日14:
重复做一次酵母菌的耐受性试验
18.4月1日14:
19.4月2日14:
20.4月3日14:
21.4月4日14:
观看酵母菌的耐受性试验现象。
实验四果酒酵母发酵
1.果浆1.2L
2.果浆中总糖含量
F(g)
G(g/ml)
V(ml)
V1(ml)
V2(ml)
V3(ml)
X(g/L)
第一次
0.0625
0.0025
23
第二次
250
第三次
23.5
187.5
第四次
22.6
130
第五次
24.2
第六次
24.8
25
式中:
X——总糖或还原糖的含量,g/L;
F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各5mL相当于葡萄糖的克数,g;
V1——吸取的样品体积,mL;
V2——样品稀释后或水解定容的体积,mL;
V3——消耗试样的体积,mL;
G——葡萄糖标准溶液的准确浓度,g/mL;
V——消耗葡萄糖标准溶液的体积,mL。
所得结果应表示至一位小数。
第一次测得果浆中糖的含量为10g/L,1.2L果浆中含糖12g,向果浆中加糖316g,最后到25g/L
测定酒度
3.果浆中酸的含量
式中:
X——样品中滴定酸的含量,g/L;
c——氢氧化钠标准溶液浓度,mol/L;
V1——样品滴定时,消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;
V0——空白滴定时,消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;
V2——吸取样品的体积,mL;
S苹果酸=0.067
V0(ml)
0.57
0.10
1.57
0.50
0.09
2.75
0.65
0.05
4.02
1.64
0.12
5.09
0.63
3.89
0.81
4.76
第七次
0.61
4.20
第一次测得果浆中酸的含量为1.57g/L,向果浆中加入苹果酸4.43g
4.取100ml果汁加50ml蒸馏水,蒸馏得100ml液体,29oC下,测得酒精度7.5o,依照酒精度温度校正表得,20oC下,果汁的酒精度8o
选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验,在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后,选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
一、实验目的和内容
1.把握果酒酿造的原理并对选择果酒酵母菌种进行发酵性能测定(起酵时刻、产酒精度、耐受性能)。
2.用实验十三所选择果酒酵母进行小型酿酒实验,把握果酒酿造一样工艺流程,并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测(糖度、酸度、酒精度)。
二、实验原理果酒发酵:
果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下,最后生成酒精和二氧化碳。
可用以下反应式来说明:
果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。
在每一步反应过程中都有酶的参与,除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外,还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个时期,主发酵是将发酵液的糖分变成酒精,后发酵是连续分解残糖为酒精,加速酒的转化,使酒更加稳固。
用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵,利用天然酵母发酵的称为自然发酵。
按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
新奇水果及压榨汁。
试剂:
亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土)或者红土;
器皿:
三角烧瓶(250mL)、无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条(0.5×
1.2cm)冰箱,低温冰箱(-30℃),液氮冷冻保藏器,玻璃涂棒,血细胞计数板,显微镜,紫外线等(15W),磁力搅拌器,台式离心机,震荡混合器等。
1.自选酵母发酵性性能的检测试验:
用选择菌种发酵果酒
(1)果酒酿造的工艺流程
鲜果→分选→破裂、除梗→果浆→分离取汁→澄清→清汁→发酵→倒桶→贮酒→过滤→冷处理→调配→过滤→成品
(2)工艺简述
1)发酵前的处理
前处理包括水果的选别、破裂、压榨、果汁的澄清,果汁的改良等。
①破裂、除梗:
破裂要求每粒种子破裂,但不能将种子和果梗破裂,否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。
破裂后的果浆赶忙将果浆与果梗分离,防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。
②二氧化硫处理:
二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。
使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐,前者可用管道直截了当通入,后者则需溶于水后加入。
发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。
(以葡萄酒为例:
二氧化硫添加量的运算:
[葡萄果实×
70%×
60]/[0.06×
1000]。
)此外,尚需考虑下述因素:
原料含糖高时,二氧化硫结合机会增加,用量略增;
原料含酸量高时,活性二氧化硫含量高,用量略减;
温度高,易被结合且易挥发,用量略减;
微生物含量和活性越高、越杂,用量越高;
霉变严峻,用量增加。
2)果汁的调整:
取汁测定果汁中糖度和酸度,依照发酵需要调整糖度和酸度。
①糖的调整:
酿造酒精含量为10%-12%的酒,果汁的糖度需17-20°
Bx。
假如糖度达不到要求则需加糖,实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。
②酸的调整:
酸可抑制细菌繁育,使发酵顺利进行;
使酒颜色鲜亮;
使酒味清新,并具有柔软感;
与醇生成酯,增加酒的芳香;
增加酒的贮藏性和稳固性。
干酒易在0.6%-0.8%,甜酒0.8%-1%一样pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。
3)酒精发酵
发酵分主(前)发酵和后发酵,主发酵时,将果汁到入容器内,装入量为容器容积的4/5,然后加入3%-5%的酵母,搅拌平均,温度操纵在20-28℃,发酵时刻随酵母的活性和发酵温度而变化