华科生物化学博士真题Word格式.docx
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PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°
高温时变性会变成单链，低温（经常是60°
C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°
C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'
-3'
）的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
6、限制酶（Endodeoxyribonuclease）：
限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
7、多克隆位点：
MCS在生物学的意义是多克隆位点（multiplecloningsite，MCS），是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restrictionsite）的一段很短的DNA序列，也称为多位点接头（polylinker），是外源基因插入的位置。
MCS是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。
MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。
常见的基因工程载体都具有多克隆位点，有些载体如λEMBL4、Charon40等甚至有两个多克隆位点。
8、基因治疗：
P251习题17
9、质粒（plasmid）：
P183习题9
1.克隆载体（CloningVector）：
克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。
将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。
常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。
2.表达载体（Expressionvectors）：
就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
表达载体四部分：
目的基因、启动子、终止子、标记基因。
3.断裂基因：
真核生物结构基因，由若干个编码序列和非编码序列互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码序列再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（splitgene）。
4.双脱氧核苷酸（Dideoxynucleotide）：
这些核苷酸亦被称为2'
3'
-双脱氧核苷酸，常被简写为ddNTPs（ddGTP、ddATP、ddTTP与ddCTP）。
5.多克隆位点：
同2003年考题
6.启动子
7.癌基因
8.核糖体结合位点：
核糖体结合位点是指mRNA的起始AUG上游约8~13核苷酸处，存在一段由4~9个核苷酸组成的共有序列-AGGAGG-，可被16SrRNA通过碱基互补精确识别的序列。
9.增强子（enhancer）：
增强子是指能够使基因转录频率明显增加的DNA序列。
增强子主要存在于真核生物基因组中。
10.开放阅读框架
1.丙酮酸羧化支路：
在糖异生途径中，由丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化丙酮酸经草酰乙酸转变成磷酸烯醇式丙酮酸的过程称为丙酮酸羧化支路。
丙酮酸羧化支路消耗ATP是丙酮酸绕过“能障”生成磷酸烯醇式丙酮酸进入糖异生途径。
2.米氏常数Km
3.基因组
4.基因工程：
基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
5.顺式作用元件
1.克隆载体
2.表达载体
3.假基因：
假基因（pseudogene）与正常基因相似，但丧失正常功能的DNA序列，往往存在于真核生物的多基因家族中，常用ψ表示。
4.微卫星序列：
SSR也称为微卫星DNA（MicrosatelliteDNA）,是一类由几个核苷酸（一般为1~6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列.由于每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，所以，SSR标记就将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。
由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性。
5.回文结构
8.多克隆位点
9.增强子
2、问答题
1、何为蛋白质变性，本质。
答：
①在某些理化因素作用下，致使蛋白质的空间构象破坏，从而改变蛋白质的理化性质和生物活性，称为蛋白质变性。
蛋白质变性的本质是其特定的空间构象被改变，导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。
变性原理：
变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。
一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。
能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等；
能使蛋白质变性的物理方法有加热（高温）、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。
2、酶的竞争性抑制。
以磺胺类药为例说明。
竞争性抑制剂的结构与底物相似，可与底物竞争结合酶的活性中心而抑制酶的活性，发挥抑制作用称为竞争性抑制作用。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及与底物浓度的相对比例。
磺胺类药物是竞争性抑制作用典型实例。
对磺胺类药物敏感的细菌在生长繁殖时，不能直接利用环境中的叶酸，而是在菌体内二氢叶酸合成酶的催化下，利用对氨基苯甲酸，谷氨酸和二氢蝶呤为底物合成二氢叶酸。
磺胺类药物的化学结构与底物对氨基苯磺酸相似，是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂而抑制二氢叶酸的合成。
二氢叶酸是四氢叶酸的前体，后者是一碳单位代谢的辅酶。
细菌由于一碳单位代谢障碍而导致核苷酸及核酸的合成受阻，其生长繁殖受到抑制。
根据竞争性抑制的特点，服用磺胺类药物时必须保持血液中的高浓度，以发挥其有效的抑菌作用。
人类能直接利用食物中的叶酸，故核酸的合成不受磺胺类药物的干扰。
3、谷氨酸如何彻底氧化。
P102（习题）
4、甘油异生为糖原过程。
①甘油在甘油激酶的催化下磷酸化生成甘油-3-磷酸。
②甘油-3-磷酸经甘油-3-磷酸脱氢酶催化脱氢转变成磷酸二羟丙酮。
③磷酸二羟丙酮在磷酸丙酮激酶催化下转变成3-磷酸甘油醛。
④3-磷酸甘油醛循糖氧化分解途径彻底分解生成H2O和CO2并释放能量。
5、比较核酸的复制与转录的相同点与不同点。
P79（武汉大学真题）
2004年分子生物学（博士）
1、简答题（10分／题）
1.如何得到IL-2的基因工程产物
IL-2的产生编辑：
IL-2主要由T细胞或T细胞系产生。
（1）CD4阳性或CD8阳性T细胞：
有丝分裂原刺激CD4阳性或CD8阳性T细胞亚群均可产生IL-2；
同种异体抗原主要刺激CD4阳性T细胞分泌IL-2。
PBMC、脾脏、淋巴结和扁桃腺中的T细胞受到刺激后都能产生IL-2。
在小鼠Th细胞中，只有Th1亚群可产生IL-2。
（2）T细胞肿瘤细胞系或白血病细胞系：
人和动物某些T细胞白血病细胞系或肿瘤细胞在有丝分裂原、钙离子载体（如A23187）或PMA刺激下可产生高水平的IL-2。
如长臂猿T细胞系MLA144可自发产生IL-2，小鼠胸腺瘤细胞系EL-4和人Jurkat细胞静止状态不合成和分泌IL-2，刺激后可分泌高水平的IL-2。
（3）T淋巴细胞杂交瘤：
T淋巴细胞杂交瘤123，FS6-14.13，HT-24A等在ConA刺激下产生IL-2。
（4）应用基因工程技术制备：
1983年Taniguchi等从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功IL-2cDNA，并在大肠杆菌中得到高水平的表达。
目前应用基因工程技术所制备和纯化的IL-2已用于临床治疗某些肿瘤和其它疾病。
2.癌基因在信号传导中的分类
3.原核基因组与真核基因组的区别（从结构、数量、序列特点等方面说明真核基因组与原核基因组的异同）
先解释一下基因组（genomes）的概念，简单说，基因组就是一个细胞中遗传物质的总量。
我们人类是二倍体，体细胞有46条/23对染色体，其实就是2套染色体，1套有23条，那么这23条染色体上所有的DNA序列就是人类的基因组。
相同点很多，比如：
都是由生物基本单位中的所有核酸序列组成，都有重复序列和单一序列，都是生物的遗传物质。
区别：
①真核生物基因组指一个物种的单倍体染色体组所含有的一整套基因。
还包括叶绿体、线粒体的基因组。
原核生物一般只有一个环状的DNA分子，其上所含有的基因为一个基因组。
②原核生物的染色体分子量较小，基因组含有大量单一顺序，DNA仅有少量的重复顺序和基因。
真核生物基因组存在大量的非编码序列。
包括：
内含子和外显子、基因家族和假基因、重复DNA序列。
真核生物的基因组的重复顺序不但大量，而且存在复杂谱系。
③原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。
质粒常为双链环状DNA，可独立复制，有的既可以游离于细胞质中，也可以整合到染色体上。
转座因子一般都是整合在基因组中。
真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。
有的真核细胞中也存在质粒，如酵母和植物。
④原核生物的DNA位于细胞的中央，称为类核。
真核生物有细胞核，DNA序列压缩为染色体存在于细胞核中。
⑤真核基因组都是由DNA序列组成，原核基因组还有可能由RNA组成，如RNA病毒。
3、选做题（10分／题）
1.PCR基本原理，主要特点，及两个衍生的PCR技术原理。
（★★★）
（1）PCR的特点及应用：
PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。
因此，广泛应用于许多领域。
①原理：
类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；
而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；
在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3'
端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5'
→3'
方向延伸，合成DNA新链。
这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。
如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
引物的设计原则：
①长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。
有时可在5'
端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要。
②两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3'
端，即使无法避免，其3'
端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成"
引物二聚体"
或"
引物二倍体"
。
③（G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。
两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。
④引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构。
⑤引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μM之间。
浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。
一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。
3.PCR扩增过程在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+存在。
其循环的温度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。
（1）变性阶段加热使模板DNA在高温下（90℃-95）变性，双链解链；
（2）退火阶段降低溶液温度，使合成引物在低温（35－65℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；
（3）延伸阶段溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。
（2）两个衍生的PCR技术原理：
①逆转录PCR或者称反转录PCR（reversetranscription-PCR,RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
②real-timeQ-PCR技术：
是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
real-timeQ-PCR技术原理：
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，DNA聚合酶的失活,dNTP和引物的枯竭，反映副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。
在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
目的：
（1）对起始模板进行定量；
（2）对某个基因进行快速/无污染的定性检测。
优点：
（1）动力学范围较宽：
可分析少量的样本，如临床活组织切片检查，可以检测少于5个拷贝的目标序列；
（2）用适当的内参物和计算方法，可使平均变异系数在I%一2%，在低水平的基因表达下也可分析基因表达的细微变化；
（3）自动化程度高；
（4）real-timePCR在封闭的容器中进行，减少了操作造成的污染。
缺点：
（1）易受影响，如临床检验或法医鉴定一些体内的流体物质，其中会有抑制剂存在食物中的微生物会被有机酚类抑制，一般选用适当的DNA聚台酶（如Tfl、Pwa、Tth等），这些酶可以排除抑制剂的干扰；
（2）分析基因表达，RNA易降解，因此提取时要保证RNA的完整性，尽可能除去核酸酶、基因组DNA、RT或PCR抑制剂的污染；
（3）采集、保存和运输都会影响RNA的品质；
（4）反转录过程也会使RNA变性。
但是最主要的是人员操作，使用real-timePCR分析基因表达，引物的设计必须严格遵循标准，确保结果的准确性。
2、试述真核基因组结构的基本特点。
（20分）
真核生物基因组有以下特点：
①真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组。
②真核细胞基因转录产物为单顺反子。
一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。
③存在重复序列，重复次数可达百万次以上。
④基因组中不编码的区域多于编码区域。
⑤大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。
⑥基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。
3、试述重组DNA的基本过程。
（20分）
（1）目的基因的获取（获取目的基因是实施基因工程的第一步.）目的基因来源（可以从自然界中已有的物种中分离出来,也可以用人工的方法合成）获取目的基因的方法：
①从基因文库中获取（基因组文库,部分基因文库）②利用PCR技术扩增目的基因（变性,复性,延伸）③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
这样就可以利用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记的探针来获取，对于较大的基因组，可以先制作基因文库，然后获取所需要的带有目的基因的片段。
（2）基因表达载体的构建（基因工程的核心）基因表达载体的组成：
目的基因、启动子、终止子、标记基因；
（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定。
4、真核生物基因表达在转录水平上是如何调控的？
5、试述基因治疗研究的主要内容或策略。
1、基因置换或称基因矫正：
特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。
2.基因添加：
通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。
3.基因干预：
采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。
4.自杀基因治疗：
将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应。
二问答题（共3小题，每小题10分，共30分）
1.什么是分子克隆技术？
它的主要步骤是什么？
P184习题1
2.真核细胞和原核细胞基因表达在转录水平上调控的特点。
真核细胞调控特点：
P171习题4；
原核细胞基因表达调控特点：
3.简述细胞内癌基因激活的方式？
P241习题2
三.选答题（任选2小题，每小题10分，共20分）
1.简述基因治疗中转移外源基因至体内的非病毒和病毒途径的主要原理
（1）病毒介导途径：
把小分子DNA用病毒蛋白包装成类病毒的样子，利用病毒蛋白形成的外壳的入侵特性将DNA释放到目的细胞内，然后利用病毒蛋白的作用将DNA插入到染色体的特殊部位进行转录翻译。
（2）非病毒途径：
主要用于大分子DNA或者害怕病毒引起副作用时使用，但是效果不如将目的DNA分子纯化或者构建成载体，利用脂质体或者其他手段将DNA转入目的细胞。
2.请你评价一下人类基因组计划（HGMP）完成的意义（科学、经济和社会的）
人类基因组计划（HumanGenomeProject，简称HGP）
HGP的研究内容：
HGP的主要任务是人类的DNA测序，包括下图所示的四张谱图，此外还有测序技术、人类基因组序列变异、功能基因组技术、比较基因组学、社会、法律、伦理研究、生物信息学和计算生物学、教育培训等目的。
1、遗传图谱（geneticmap）2、物理图谱（physicalmap）3、序列图谱4、基因图谱
HGP对人类的重要意义：
1、HGP对人类疾病基因研究的贡献
人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。
对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。
对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。
健康相关研究是HGP的重要组成部分，1997年相继提出：
“肿瘤基因组解剖计划”“环境基因组学计划”。
2、HGP对医学的贡献
基因诊断、基因治疗和基于基因组知识的治疗、基于基因组信息的疾病预防、疾病易感基因的识别、风险人群生活方式、环境因子的干预。
3、HGP对生物技术的贡献
（1）基因工程药物：
分泌蛋白（多肽激素，生长因子，趋化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受体。
（2）诊断和研究试剂产业：
基因和抗体试剂盒、诊断和研究用生物芯片、疾病和筛药模型。
（3）对细胞、胚胎、组织工程的推动：
胚胎和成年期干细胞、克隆技术、器官再造。
4、HGP对制药工业的贡献：
筛选药物的靶点：
与组合化学和天然化合物分离技术结合，建立高通量的受体、酶结合试验以知识为基础的药物设计：
基因蛋白产物的高级结构分析、预测、模拟—药物作用“口袋”。
个体化的药物治疗：
药物基因组学。
5、HGP对社会经济的重要影响：
生物产业与信息产业是一个国家的两大经济支柱；
发现新功能基因的社会和经济效益；
转基因食品；
转基因药物（如减肥药，增高药）
6、HGP对生物进化研究的影响：
生物的进化史，都刻写在各基因组的“天书”上；
草履虫是人的亲戚—13亿年；
人是由300～400万年前的一种猴子进化来的；
人类第一次“走出非洲”（200万年的古猿）；
人类的“夏娃”来自于非洲，距今20万年（第二次“走出非洲”）？
7、HGP带来的负面作用：
侏罗纪公园不只是科幻故事；
种族选择性灭绝性生物武器；
基因专利战；
基因资源的掠夺战；
基因与个人隐私。
3.就你所知RNA研究领域中，理论和技术方面的进展有哪些。
（★）
RNA研究的七大发展方向：
1.RNA信息学：
该领域的前沿方向包括：
①构建针对非编码RNA结构和功能预测的算法、数学模型、数据库和分析服务平台；
②系统发掘新的非编码RNA基因资源和解析非编码RNA的调控网络功能；
③开发基于非编码RNA的临床和农业等转化应用生物信息技术平台。
实现以下发展目标：
①在非编码RNA的鉴定方面，建立一系列突破性的计算机算法和数学模型去发现新型的非编码RNA；
②构建新的计算RNA组学理论和技术体系去解析各种非编码RNA功能和调控网络；
③开发新的算法和技术以发掘一批可用于人类重要疾病诊断和治疗的非编码RNA标志物；
④建立国际先进的非编码RNA知识库和可视化交互的RNA组学分析平
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