微生物限度检查方法验证方案Word文档格式.docx

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5.5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方法11

5.5.5控制菌检查方法验证方法17

5.5.6验证结论20

6.验证结果评价和建议21

6.1验证进度21

6.2验证结果评估与结论21

6.3验证会审21

6.4最终批准21

7．附件21

8．培训22

1.背景：

根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

2.目的：

为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准。

3.范围：

本验证方案适用于养胃舒软胶囊的微生物限度检查方法的验证。

4.验证组织及职责：

4.1验证小组组织：

组长：

。

组员：

4.2职责：

4.2.1验证领导小组职责：

负责验证方案的审批；

负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施；

负责验证数据及结果的审核；

负责验证报告的审批；

负责发放验证合格证书。

4.2.2质量管理部职责：

负责制定分析方法验证的标准、限度、检查方法；

负责制定分析方法的验证方案，并组织实施；

负责仪器设备的操作；

负责各项目的取样和检测；

负责收集各项验证、试验记录，并对试验结果进行分析后，起草验证报告，报验证领导小组。

4.2.3设备动力车间责：

负责保证各仪器设备处于完好状态。

4.2.4质量负责人职责

负责验证方案/报告的批准。

5.验证内容：

5.1验证要求：

5.1.1验证前的准备：

进行微生物限度检查方法验证前，应选用合格的培养基和试验菌种，所有的平皿、培养基、稀释剂和检验用具都应严格按照相关的程序灭菌或消毒，以确保其对试验结果没有影响。

试验菌应包括G-和G+并不得超过五代。

5.1.2验证试验操作计划：

用3个不同批号产品或同一批号产品进行3次独立的平行试验，按微生物限度检查方法进行操作，通过计算回收率或试验菌生长情况来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。

方法验证试验可与供试品的微生物限度检查同时进行。

5.1.3验证试验可接受标准：

通过3次独立的平行试验，细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证时，稀释剂对照组和试验组的菌数回收率均不得低于70%；

控制菌检查方法验证时，阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌生长。

5.2前瞻性风险评估：

5.2.1评估方法：

对检验方法潜在的风险做出评估。

根据风险的严重性（R）、发生的可能性（P）、各项指标等级进行打分，风险测量值为二个指标等级分的乘积，即风险得分为RPN。

5.2.2风险评估评分表

分数

可能性

严重性

1

发生的可能性很低

对产品质量，设备及人员安全、GMP无影响

2

很少发生

对产品质量，设备及人员安全、GMP有潜在影响

3

偶尔发生

可能对产品质量，设备及人员安全、GMP产生影响

4

极易发生

直接或严重影响产品质量，设备及人员安全、GMP

5.2.3风险评估方法

按照以上风险评估评分表对各项确认逐项进行打分（风险得分=严重性×

可能性），得分1～4分为低风险，低风险为可接受标准，6～8分为中风险，须加强管理或采取相关措施加以控制，9～16分为高风险，须进行风险控制，制定整改措施，再确认评估风险，直至风险可接受。

5.2.4风险评估结果：

潜在的风险

风险分析

风险评价

发生的可能性

RPN

人员资质、培训、健康状况

文件指导性、可操作性

物料或制剂自身易染菌性、均匀性、包装质量

试验菌生长情况、菌液浓度均匀性

取样、检验操作规范性

结果评估：

评估人/日期：

5.3人员评估：

评估参与微生物限度检查方法的所有人员，其培训检查情况是否符合2010年版GMP要求。

5.3.1评估方法：

查阅培训档案，确认是否对参与微生物限度检查方法验证的所有人员进行了相关培训及健康检查，检查内容包括：

5.3.1.12010年版GMP及药品管理法培训；

5.3.1.2灭菌和消毒管理规程及实验室安全管理规程培训；

5.3.1.3微生物基础知识及微生物污染的防范培训；

5.3.1.4微生物检查方法验证管理及检查法操作规程培训；

5.3.1.5取样操作规程、相关质量标准及标准检验操作规程的培训；

5.3.1.6人员进出实验室操作规程培训、物品进出实验室操作规程培训；

5.3.1.7岗位操作规程培训；

5.3.2合格标准：

参与微生物限度检查方法验证的所有人员，已经接受了相关的知识及操作技术培训，并经考核合格，持证上岗；

5.3.3人员培训检查报告：

培训主要内容（摘要）

培训对象、培训情况

姓名

职务/岗位

培训情况

检查人/日期：

复核人/日期：

5.4检查方法评估：

5.4.1实验条件评估：

5.4.1.1评估方法：

查阅验证或确认合格证书，确认验证所用设备及系统是否符合验证要求。

包括：

5.4.1.1.1消毒灭菌设备验证合格。

5.4.1.1.2净化检验室空气系统验证及消毒效果验证合格。

5.4.1.1.3洁净工作台验证合格。

5.4.1.1.4培养箱确认合格。

5.4.1.1.5培养基适用性检查合格。

5.4.1.1.6试验菌株符合要求。

5.4.1.2合格标准：

用于微生物限度检查方法验证的各设备或系统等实验条件均验证或确认合格，并在有效期内，所用培养基和试验菌株均符合要求。

5.4.1.3设备或系统评估报告：

设备或系统名称

设备编码

验证或确认报告编码

检查情况

SPX-80BS-Ⅱ型生化培养箱

MJ-160S-Ⅱ型霉菌培养箱

LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器

YJ-875SDB型净化工作台

微生物室空气净化系统

检查人/日期

复核人/日期

5.4.1.4培养基评估报告：

脱水培养基名称

生产商

培养基批号

适用性检查

营养琼脂培养基

玫瑰红钠琼脂培养基

胆盐乳糖培养基（BL）

4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）

营养肉汤培养基

改良马丁培养基

5.4.1.5试验菌株评估报告：

试验菌株名称

菌株批号

传代次数

菌株生长情况

大肠埃希菌[CMCC（B）44102]

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]

白色念珠菌[CMCC（B）98001]

黑曲霉菌[CMCC（B）98003]

5.4.2验证前提文件评估：

5.4.2.1评估标准要求：

5.4.2.1.1取样方法已经批准，其中包括取样操作规程和取样地点。

5.4.2.1.2质量标准及操作规程已经批准。

5.4.2.1.3微生物限度检查法操作规程已经批准。

5.4.2.1.4检定菌管理规程已经批准。

5.4.2.2评估项目及结论评估：

确认无菌检查方法验证的文件已建立，内容全面、详细、准确，已签发，符合验证要求。

5.4.2.3验证前提文件评估报告：

存放地点

微生物检查方法验证管理规程

成品取样管理规程

养胃舒软胶囊质量标准

养胃舒软胶囊检验标准操作规程

微生物限度检查法

检定菌管理规程

5.5验证实施：

5.5.1试验前的准备:

5.5.1.1试验用具的准备：

将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30min，在3天内使用。

5.5.1.2试验用培养基的制备：

取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15min，在3周内使用。

5.5.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：

取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15min，在3周内使用。

5.5.2试验菌的制备和稀释：

5.5.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：

5.5.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；

取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；

取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。

5.5.2.1.2将上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释制成每1ml含菌50～100cfu的试验菌液。

在黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养基中，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱（菌悬液），用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌50～100cfu的试验孢子液。

5.5.2.1.3上述菌液在供试验的同时，取1ml注皿、培养、计数；

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培养48小时，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，于23～28℃倒置培养72小时。

5.5.2.2控制菌检查方法验证用菌液：

5.5.2.2.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，在30～35℃培养18～24小时。

5.5.2.2.2取上述均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释，制成每1ml含菌10～100cfu的试验菌液。

5.5.2.2.3上述菌液在供试验的同时，取1ml注皿、注入营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培养48小时，计数。

5.5.3供试液的制备：

5.5.3.1根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

5.5.3.2，取供试品养胃舒软胶囊5g，加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：

20的供试液。

5.5.3.3供试液的制备如需用水浴加温时，温度不得超过45℃，时间不得超过30min。

5.5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方法:

5.5.4.1验证试验分4组，照《微生物限度检查法》操作，分别用3个不同批号样品进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照试验组的菌回收率。

5.5.4.2试验组：

5.5.4.2.1平皿法：

分1：

20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。

5.5.4.2.2薄膜过滤法：

取1：

20的供试液1～10ml，加至100ml稀释液中混匀，按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥）。

用适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量约100ml，总冲洗量不得超过1000ml，在最后一次冲洗液中加入一种试验菌液1ml（含菌50～100CFU），滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于相应的经预培养合格的培养基平板上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基平板。

每株试验菌平行制备2个平板。

5.5.4.3菌液组：

取试验菌液各1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。

5.5.4.4供试品对照组：

5.5.4.4.1平皿法：

20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。

5.5.4.4.2薄膜过滤法：

20的供试液1～10ml（取用量同试验组），加至100ml稀释液中混匀，按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥）。

用冲洗液冲洗滤膜，冲洗液、冲洗量及冲洗次数同试验组，滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于经预培养合格的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上，每种培养基平行制备2个平板。

5.5.4.5稀释剂对照组：

若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。

5.5.4.5.1平皿法：

分别取1ml稀释剂或缓冲液和1ml试验菌液（含菌50～100CFU），注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。

5.5.4.5.2薄膜过滤法：

每个滤桶内加入100ml稀释液，按薄膜过滤法过滤，用冲洗液冲洗滤膜，冲洗液、冲洗量及冲洗次数同试验组，在最后一次冲洗液中加入一种试验菌液1ml（含菌50～100CFU），滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于相应的经预培养合格的培养基平板上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基平板。

5.5.4.6倾注培养基：

在菌液组各平皿中分别倾注15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，其中，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固。

5.5.4.7培养观察：

用于细菌计数的营养琼脂培养基平板，倒置于30～35℃的培养箱中，培养48小时；

用于霉菌、酵母菌计数的玫瑰红钠琼脂培养基平板，倒置于23～28℃的培养箱中，培养72小时。

逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。

5.5.4.8菌落计数：

将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察并记录结果。

5.5.4.9计算回收率

试验组回收率＝

试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数

×

100%

菌液组的平均菌落数

稀释剂对照组回收率＝

稀释剂对照组的平均菌落数

5.5.4.10结果判定：

在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于70％。

试验组的菌回收率均不低于70％，则照该供试液制备方法和计数法测定。

若任一次试验中试验组的菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。

5.5.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：

第一次：

样品名称

试验日期

规格

样品批号

生产商

类别

供试液的制备及处理

□保温振摇法□研钵法□匀浆仪档min

□水溶性供试品：

供试品g（ml），加稀释剂ml，制成1：

供试液；

取供试液ml，冲洗次数次，每膜冲洗量ml。

□非水溶性供试品：

供试品g（ml），加乳化剂（名称；

批号）g（ml），加稀释剂ml，制成1：

□其它：

。

计数方法

细菌计数

霉菌和酵母菌计数

培养基名称

配制批号

培养温度

培养起止时间

菌种名称

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

菌种编号

菌悬液批号

菌液稀释倍数

试验组

（cfu）

平均

菌液组

稀释剂对照组（cfu）

供试品对照组（cfu）

试验组回收率（%）

稀释剂对照组回收率（%）

结论

第二次：

第三次：

5.5.5控制菌检查方法验证方法:

5.5.5.1根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌，选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。

验证试验分3组，分别用3个不同批号样品或同一批号样品进行3次独立的平行试验。

5.5.5.2试验组：

5.5.5.2.1平皿法：

10的供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）和1ml试验菌液（含菌10～100CFU），加入同一增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。

5.5.5.2.2薄膜过滤法：

10的供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥）。

用适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量约100ml，总冲洗量不得超过1000ml，在最后一次冲洗液中加入1ml试验菌液（含菌10～100CFU），滤过，取出滤膜，放入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。

5.5.5.3阳性对照：

取1ml试验菌液（含菌10～100CFU），加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。

5.5.5.4阴性对照：

取10ml稀释剂或缓冲液替代供试液，加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查