氧化锌结合迷迭香提取物预防视网膜光损伤.docx

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氧化锌结合迷迭香提取物预防视网膜光损伤

氧化锌结合迷迭香提取物预防视网膜光损伤

丹尼尔T.Organisciak，1 R.M.达罗，1 C.M.拉普，1个J.P.斯马茨，2 D.W.阿姆斯特朗，2和JC郎2

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抽象

目的

氧化锌有效地减少了暴露于强可见光的大鼠的视觉细胞损失，并且已知在与年龄有关的黄斑变性的晚期阶段减慢疾病的进展速度。

我们的目标是确定光诱导的氧化性视网膜损伤的动物模型中氧化锌与新型和完善的抗氧化剂结合的功效。

方法

一组雄性Sprague-Dawley大鼠在有或没有迷迭香粉去污剂提取物的情况下用氧化锌预处理，然后暴露于强可见光下4-24小时。

根据年龄相关性眼病研究小组的第一项临床试验的建议，另一组动物接受了氧化锌和迷迭香油的混合稀释，该迷迭香油用多不饱和脂肪酸（ROPUFA）的混合物稀释，第三组动物接受了含有氧化锌的抗氧化剂矿物质混合物。

AREDS1）。

在强光处理后2周，通过测量视紫红质和感光细胞DNA水平确定视觉细胞存活，并通过视网膜组织学和DNA的琼脂糖凝胶电泳确认。

Western分析用于确定锌和抗氧化剂对氧化应激指标，神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP），血红素加氧酶-1（HO-1）和羧乙基吡咯（CEP）。

视杆和视锥蛋白和视紫红质的水平被用作感光细胞功能的标志物。

结果

用1.3mg/kg氧化锌和17mg/kg迷迭香提取物或二分之一剂量处理的暗养大鼠，暴露于中等强度的绿光下，其裸藻和视网膜DNA的75％–85％处于未暴露状态大鼠。

这些水平明显高于单独使用氧化锌或迷迭香处理所发现的水平。

迷迭香油与氧化锌混合时也有效，但单独的ROPUFA并不比洗涤剂载体更有效。

长时间的强烈绿光导致视网膜GFAP和HO-1水平升高，视锥细胞视蛋白以及视杆和视锥抑制蛋白降低。

迷迭香加锌处理降低了氧化应激蛋白标志物的表达并提高了视觉细胞的存活率，这表现为感光细胞形态的改善和视网膜DNA降解的减少。

使用较高强度的白光照射循环光秃的大鼠，发现用AREDS抗氧化剂/矿物质混合物治疗无效，而迷迭香提取物加等剂量的氧化锌在保存视觉细胞方面更为有效。

所有抗氧化剂处理均能降低CEP蛋白加合物的形成，但迷迭香加氧化锌也比AREDS更有效地防止了视锥细胞视蛋白和视紫红质的损失。

结论

在急性视网膜光损伤的大鼠模型中，氧化锌与迷迭香粉或迷迭香油的去污剂提取物相结合，比单独使用任一成分治疗更有效，并且比含相当剂量氧化锌的AREDS混合物明显更有效。

在视网膜变性动物模型中，光诱导的氧化应激可能是有用的临床前范例，可用于筛选新型抗氧化剂并测试旨在减缓与年龄有关的眼病进展的潜在疗法。

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介绍

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种多因素疾病与涉及补体系统强遗传组分[ 1 - 4 ]，并用氧化和炎症[相关联的视力丧失的风险增加4，5 ]。

流行病学表明，尽管年龄是视力丧失的主要危险因素，吸烟诱发的氧化应激增加，至少有两方面的[风险5 - 9 ]。

蛋白质组学证据表明，在布鲁氏膜-脉络膜视网膜色素上皮（RPE）复合物的玻璃膜疣分离的尸体中发现了氧化蛋白质损伤[ 10]。

从AMD患者的玻璃疣被发现含有更高水平的氧化的脂质-蛋白质加合物和α-晶状体的比正常年龄匹配的对照中发现[ 10，11 ]。

一个相关的危险因素是低血清抗氧化剂指数[ 5，12 ]。

在年龄相关性眼病研究（AREDS）中，服用抗氧化剂/矿物质混合物的人中含有维生素A（如β-胡萝卜素），C和E以及锌和锌的抗氧化剂/矿物质混合物，降低了中晚期至晚期AMD的疾病进展速度氧化铜[ 12 ]。

在大约四分之一的晚期病例中，使用AREDS维生素/矿物质混合物进行治疗可导致新血管形成率下降，但锌似乎是其中最大的受益者[12]。

锌已知能够提高补体因子H（CFH），以因子C3B的结合，导致补体介导的细胞裂解的抑制[ 8，13 ]。

CFH还结合丙二醛修饰的蛋白质上的表位，丙二醛是脂肪酸氧化的副产物，导致抑制进一步的氧化损伤并降低促炎反应[ 14 ]。

在视网膜变性的动物模型中，抗氧化剂和微量元素锌还可以降低氧化应激并延长感光细胞的寿命。

在光诱导的视网膜变性模型中，许多抗氧化剂能够减少组织损伤的程度和视觉细胞的损失，提供了令人信服的证据，暗示了氧化损伤[ 15 ]。

使用剂量-反应曲线确定相对抗氧化功效，发现草药迷迭香（迷迭香）的洗涤剂提取物在预防视网膜光损伤方面比维生素C约高十倍[ 16]。

迷迭香已知含有酚类抗氧化剂，包括鼠尾草酚，鼠尾草酸，迷迭香酚，迷迭香酸，和熊果酸的复杂混合物[ 17 - 20 ]。

最近，发现用氧化锌在AREDS推荐水平或以上对大鼠进行预处理[ 21 ]可以减少视网膜光损伤并增加视觉细胞存活率[ 22 ]。

类似地，在糖尿病性视网膜病的动物模型中，发现基于AREDS微量营养素混合物的每日施用以减少氧化和视网膜病变[ 23，24 ]。

啮齿类动物视网膜中杆状和锥状感光体的镶嵌结构与灵长类动物不同，这限制了我们在物种之间外推的能力。

但是，AMD病因的某些方面可以在啮齿动物模型中复制[ 25 ]。

例如，Hollyfield及其同事[ 26 ]用羧乙基吡咯（CEP）免疫小鼠，加到小鼠血清白蛋白上，发现布鲁赫膜发炎性变化以及玻璃疣的积聚。

重要的是，CEP是由22：

6n-3脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA）的氧化形成的，DHA在感光细胞中大量存在，而在玻璃疣中则是氧化的蛋白质加合物[10]。

在一项相关的研究中，发现具有超氧化物歧化酶（SOD）基因缺失的小鼠模型在Bruch膜和RPE中表现出年龄依赖性的病理变化，并且光线过多会加剧这种变化[ 27 ]。

使用大鼠急性光诱导的光毒性模型，发现视网膜小胶质细胞的活化和迁移[ 28 ]以及巨噬细胞浸润[ 29 ]可以刺激替代性补体途径并介导该区域中C3，B和CFH的沉积光的病变[ 28，29 ]。

最后，马克等。

[30]将光损伤大鼠视网膜的末期形态与晚期萎缩性AMD的变化进行了比较，并发现了损伤后视网膜重构的显着解剖相似性。

作为氧化应激的模型并测试各种抗氧化剂和锌组合的保护功效，我们使用了光诱导性视网膜变性的大鼠模型。

我们发现，用去污剂或多不饱和脂肪酸和去污剂的混合物乳化的迷迭香提取物和水性氧化锌均能有效减少视网膜损伤并增加视觉细胞存活率。

迷迭香与锌结合的保护作用要比单独使用任何一种化合物都要大，并且比典型的AREDS维生素/矿物质混合物中的结合成分要好[ 12]。

氧化锌与酚类抗氧化剂的组合使用可为氧化性组织损伤的机理提供新的见识，并为旨在减缓或预防AMD进展的疗法提供了新的可能性。

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方法

动物，饲养条件，强光处理：

从HarlanInc.（印第安那州印第安纳州）获得雄性Sprague-Dawley大鼠作为断奶仔猪，让其适应黑暗或昏暗的周期性光照40天。

每天在黑暗环境中打扰不到30分钟，以进行常规动物维护。

在这些期间，使用暗红色的光（>600nm）照亮房间。

循环光照环境包括每天12小时白光–每天12小时暗，由7W“夜间灯”提供的光固定在聚碳酸酯动物笼子上方的多个出口条中的笼子架上。

通过调节线电压来调节光强度，以提供10–20lux的昏暗照明环境，每天晚上8点亮灯。

给所有动物喂食RatChow（威斯康星州麦德逊市的Teklad），并随意饮水。

在P60-P65，使用两种测试范例之一将大鼠暴露于强烈的可见光下。

将深色饲养的大鼠在圆形绿色Plexiglas＃2092（GEPolymerShapes，Dayton，OH）室中用490–580nm的光处理4h[ 31强度为1200勒克斯。

一些暗养的动物暴露于光线下长达24小时。

循环饲养光的大鼠在透明的Plexiglas密室中以9000勒克斯的强度暴露于全光谱白光（400-700nm）中6小时。

对于任一曝光范例，在每个腔室中对两只大鼠进行治疗，所有曝光均在上午9点开始。

为了进行抗氧化剂治疗，将大鼠黑暗适应过夜，然后在开始曝光前1小时进行腹膜内（IP）注射。

用赋形剂治疗的大鼠也要适应黑暗，然后暴露在强烈的可见光下，通常在与抗氧化剂治疗的动物相同的室内。

光照后，将所有大鼠移入黑暗中1-2天以进行蛋白质和DNA凝胶电泳，或移动14天以评估可见细胞的存活。

用CO 2杀死大鼠-暗红色照明下的饱和气氛。

在本次调查中对动物的使用符合美国视觉与眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明以及莱特州立大学实验动物护理和使用委员会的指导原则。

抗氧化剂

迷迭香粉由LycoRedLtd.（以色列BesSheva，以色列）提供，并从AlconLtd.（FortWorth，TX）获得。

该粉末以25mg/ml的浓度使用。

首先将其用100％乙醇（0.1ml/25mg）润湿，用氩气冲洗，加盖，并在室温下于黑暗中放置2小时。

然后用1％Tween-80水溶液（Sigma，圣路易斯，密苏里州）将浆液定容，在80％设置下进行超声处理（2×10s脉冲）（Biosonic；BronwellScientific，Rochester，NY），用氩气冲洗，盖上盖子，涡旋，并在4℃下保持过夜。

第二天早晨，将混合物再次涡旋，并将适当体积的均匀乳化的悬浮液腹膜内注射到实验动物中。

LycoRedLtd.还提供了可溶解在DSM（瑞士Kaiseraugst，瑞士）的omega-3多不饱和脂肪酸乙酯（ROPUFA；75N-3EE）混合物中的迷迭香油提取物，并从Alcon获得。

将溶解的混合物（RSEE1030061）用1％Tween-80/10％乙醇（载体）稀释，通过涡旋乳化，制备后立即使用。

通过IP注射给大鼠增加迷迭香油提取物的量，可以确定剂量反应。

迷迭香油和ROPUFA的储存都在4°C的氩气下进行。

粉末和油制剂中迷迭香的活性水平在本文随附的补充信息（附录1）中进行了报告。

氧化锌（ZnO）购自AlfaAesar（马萨诸塞州，沃德希尔），并以2mg/ml的浓度溶于酸化水（pH2）中。

可从当地获得商业化的AREDS1抗氧化剂/矿物质制剂（ICAPS，AlconLtd.）。

用含有16％乙醇和20％ROPUFA的1％Tween-80将1软胶囊的内容物调至25ml。

然后将混合物涡旋并立即使用乳液。

AREDS建议的60公斤维生素C和E，β-胡萝卜素，氧化锌和铜的每日剂量[ 12 ]为7.53；6.67; 0.29；分别为1.44和0.027mg/kg（附录1）。

AREDS清洁剂/ROPUFA提取物通过IP注射给药，并以接近每日锌推荐剂量的水平给予。

感光细胞存活和抗氧化剂功效：

为了评估抗氧化剂混合物防止光诱导的感光细胞丧失的能力，我们在强光处理后2周常规测量视紫红质和视网膜DNA的水平。

为了进行这些测定，在每只大鼠的一只眼中测量了视紫红质，而在另一只眼中测量了视网膜DNA。

视紫红质是在EmulphogeneBC-720（Sigma）的去污剂提取物确定为[描述21，22]。

首先在黑暗中测量，然后在漂白实验样品提取物后，将其在500nm处的吸光度降低与未暴露的对照大鼠眼睛的吸光度进行比较。

通过这些测量，将光感受器细胞存活率计算为每只眼睛nmol视紫红质。

类似地，视网膜DNA，用Hoechst公司（Calbiochem公司-Behring公司，拉霍亚，CA）染料结合测定法测得的21，22在实验和对照大鼠视网膜中比较。

然后通过减去视网膜内层的DNA含量来确定感光细胞DNA，并以每个视网膜的μgDNA表示。

由光损伤后视觉细胞存活的平均值确定对各种抗氧化剂的保护功效。

它基于视紫红质和感光细胞DNA在实验动物中以及在用媒介物处理并暴露于强可见光的动物中的各自保留[ 22 ]。

组织学

光线处理2周后摘除大鼠眼睛，并使其定向，因此可以标记上半球，以确保在组织处理过程中能够识别出眼睛。

切下镜片并将眼罩在50％Karnovsky溶液中固定24小时。

然后将组织转移至pH7.4的0.1M椰油酸钠缓冲