微生物与基因工程Word文档下载推荐.docx
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借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。
同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。
仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。
二、基因工程的基本过程
生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。
基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。
基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。
克隆的基因需要进行鉴定或测序。
控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得新的性状。
这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。
基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：
①分离或合成基因；
②通过体外重组将基因插入载体；
③将重组DNA导入细胞；
④扩增克隆的基因；
⑤筛选重组体克隆；
⑥对克隆的基因进行鉴定或测序；
⑦控制外源基因的表达；
⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物。
上述步骤可用图10-1来表示。
图10-1基因工程基本操作过程示意图
三、微生物学与基因工程的关系
微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。
从以下六个方面可以说明：
①基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；
②基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；
③微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；
④为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；
⑤微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；
⑥有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。
第二节微生物与克隆载体
外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。
这种以扩增外源DNA为目的载体，称为克隆载体（cloningvector）。
作为克隆载体的基本要求是：
（1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制。
因此载体应是一个独立的复制子（replicon），具有复制起始序列，可在细胞中进行有效扩增。
（2）载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入。
并且由于这些酶切位点位于载体复制的非必需区，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍然能够进行正常的复制。
（3）载体必须具有可供选择的遗传标记，例如具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。
（4）载体DNA须易于生长和操作。
到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：
质粒载体；
λ噬菌体载体；
柯斯质粒载体；
M13噬菌体载体；
真核细胞的克隆载体；
人工染色体等。
一、质粒克隆载体
1.质粒克隆载体的特性
当前分子克隆中所用的克隆载体，绝大多数是利用细菌的质粒，经人工修饰改造而成。
质粒作为克隆载体，具有十分有利的特性：
（1）具有独立复制起点作为克隆载体的质粒，通常都含有一个复制起点，这是质粒在宿主细胞中进行扩增的必要条件。
（2）具有较小的分子量质粒是染色体外DNA，通常由环形双链DNA构成，其分子大小约为1～200Kb。
低分子量有利于DNA的分离和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超过15Kb。
（3）具有较高拷贝数每个细胞可含有10～200个拷贝的松弛型复制质粒。
当加入蛋白质合成抑制剂（如氯霉素等），还可大大增加细胞中质粒的拷贝数，每个细胞可含有高达数千个拷贝的质粒，使外源DNA得以大量扩增。
（4）具有便于选择的标记某些质粒中存在着抗生素的抗生基因，便于对克隆基因的检测和筛选。
（5）易于导入细胞质粒可通过转化或电穿孔等方法极易被导入细胞。
（6）具有安全性作为载体的质粒不具有转移功能，防止带有外源DNA的重组质粒扩散至实验室外，以免造成危害。
2．质粒pBR322的结构特点
大肠杆菌质粒pBR322是基因工程中最常用和最具代表性的质粒（图10－2），它是由博利瓦（Bolivar）等人于1977年构建而成的，是一个典型的人工质粒载体。
质粒pBR322是环状双链DNA分子，由4361bp组成。
可插入外源DNA大小为5kb左右，外源DNA若超过10kb，质粒在复制时就会变得不稳定。
它具有一个复制起点，是松弛型质粒，故细胞中具有较高的拷具数，每个细胞含有20～30个拷贝。
当加入氯霉素扩增之后，每个细胞可含有1000～3000个拷贝，大大有利于重组质粒在细胞中的扩增。
此外，pBR322还具有两种抗生素的抗性基因，一个是四环素抗性基因（Tetr）另一个是氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。
已知有24种主要限制酶在pBR322上都只有一个切点，其中有7种限制酶（EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII、NruI）的切点位于四环素抗性基因之内，还有3种限制酶（ScaI、PvuI和PstI）的切点位于氨苄青霉素抗性基因之内。
外源DNA片段插入这些位点之中任一位点时，将导致相应的抗性基因的失活。
这种因外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（insertionalinactivation）。
图10-2质粒pBR322结构图
插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体（图10－3），例如若在质粒pBR322的BamHI的位点插入外源DNA，然后转化大肠杆菌（Tets、Amps）。
含有重组质粒（即带有外源DNA的质粒）的宿主细胞失去对四环素的抗性，所以不能在含有四环素培养基的平板上生长，但仍能在含有氨苄青霉素培养基的平板上生长。
而那些含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，则可以在含有四环素或氨苄青霉素培养基的平板上生长，这样就很容易筛选到含有目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌。
图10-3插入失活示意图
3.其它质粒载体
现在已构建许多新的质粒载体（如pUC系列和pGEM系列的质粒载体），它们具有更多有用的特点并且使用起来更方便。
这些载体的优点之一，在质粒载体上含有一个人工构建的多接头位点（polylinker）或多克隆位点（multiplecloningsite），这是一个带有不同限制酶单一识别位点的短的DNA片段，外源基因可随意插入任何一个切点。
同时又由于多克隆位点常位于一个基因的编码区之中，因此，基因的插入失活极易被检测到。
除大肠杆菌质粒外，枯草芽孢杆菌质粒也可作为质粒载体之用。
此外，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的2mm质粒常作为酵母细胞外源基因的克隆或表达载体。
为了便于基因工程工作，人们先后构建了一系列不同类型的穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）。
这是一类同时含有两种细胞的复制起点（特别是同时含有原核与真核生物的复制起点），能在两种生物细胞中进行复制的质粒载体。
其中最为常见和被广泛应用的是大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，这种质粒同时含有大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点，故既可在大肠杆菌细胞中复制又可在酵母细胞中进行复制。
此外还有其他穿梭质粒载体系统。
二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点：
①它的分子遗传学背景十分清楚。
②λ噬菌体载体的容量较大。
一般质粒载体只能容纳10多个kb。
而λ噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段。
③具有较高的感染效率。
其感染宿主细胞的效率几乎可达100％，而质粒DNA的转化率却只有0.1％。
以上优点为克隆较大片段的外源DNA提供了有利条件，并可大大增加构建基因库的效率。
1.λ噬菌体载体的构建
野生型λ噬菌体DNA不适于作为克隆载体，因为它的DNA分子很大，基因组结构复杂，限制酶有很多切点，并且这些切点多数位于必需基因之中等等。
为了避免上述问题，需经一系列改造。
构建λ噬菌体克隆载体的基本原则是：
①删除基因组中非必需区，使基因组变小，有利于克隆大的DNA片段。
②除去多余的限制位点。
现已构建了各种各样的λ载体。
这些载体可分为两类：
一类称为插入型载体（insertvector）其限制酶位点可用于外源DNA的插入；
另一类称为取代型载体（replacementvector）具有成对限制酶位点，外源DNA可取代两个限制位点上的DNA区段。
重组DNA与包装蛋白混合，可在体外包装成有感染力的重组噬菌颗粒。
虽然λ噬菌体载体是一类极为有用的克隆载体，但是由于λ噬菌体头部组装时容纳DNA的量是固定的，因此插入外源DNA的长度必须控制在使重组DNA为野生型λDNA长度的78％～105％之间，否则不能正常组装。
三、柯斯质粒载体
柯斯质粒载体（cosmidvector）即粘粒载体，是由λ噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。
cosmid一词的意思是带有cos位点的质粒。
柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自λ噬菌体粘性末端的DNA片段，即cos位点。
它对于将DNA包装成λ噬菌体粒子是必需的。
柯斯质粒载体的优点：
①具有噬菌体的高效感染力。
而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在。
②具有质粒DNA的复制方式。
重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA分子，如同质粒一样进行复制。
③具有克隆大片段外源DNA的能力。
这是柯斯质粒的最大优点。
柯斯质粒本身一般只有5～7kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能力。
四、M13噬菌体载体
M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6407bp。
感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌并进入细胞后，转变成复制型（RF）dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。
每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）被释放至胞外。
野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体（图10-4）。
在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均为复制和组装所必需的基因。
外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对野生型M13的改造主要在IG区中进行。
图10-4噬菌体载体M13mp18的结构示意图
（1）插入β–半乳糖苷酶选择标记在IG区中插入β–半乳糖苷酶N端一小段编码序列及其调控序列，该序列编码β–半乳糖苷酶的α肽，α肽可与大肠杆菌LacZ突变基因M15进行α互补，产生具有活性的β–半乳糖苷酶。
若将M13和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和呈色物质5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X–gal）培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌斑。
（2）插入一小段多克隆位点区在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会破坏α互补作用。
这时若将M13（含外源DNA）和宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板上，则形成无色噬菌斑。
M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300～400bp的外源DNA片段，它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因的单链DNA。
因此，它主要被用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链DNA探针，定位诱变等。
也可用于噬菌体展示（phagedisplay）。
五、噬菌质粒载体
噬菌质粒（phagemid或phasmid）是由丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点，这类载体具有来自M13或f1噬菌体的基因间隔区（内含M13或f1噬菌体复制起点）和来自质粒的复制起点，抗药性标记，一个多克隆位点区等。
例如pUC118噬菌质粒载体就是在野生型M13的基因间隔区插入质粒载体pUC18构建而成的。
噬菌质粒在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链DNA。
当用辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，噬菌质粒的复制就转变成如同M13噬菌体一样的滚环复制，产生单链DNA并被包装成噬菌体粒子，以出芽方式释放至胞外。
噬菌质粒载体在应用上具有许多优点：
①载体本身分子小，约为3000bp，便于分离和操作。
②克隆外源DNA的容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb外源DNA片段。
③可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。
现将上述几类大肠杆菌克隆载体的克隆能力及其主要用途列表比较（表10-1）
表10-1几类大肠杆菌克隆载体比较
载体类型
克隆外源DNA片段大小
主要用途
质粒载体
<
15kb
克隆和表达外源基因；
DNA测序
λ噬菌体载体
23kb
构建基因文库和cDNA文库
柯斯质粒载体
45kb
构建基因文库
M13载体
300~400bp
制备单链DNA；
定位诱变；
噬菌体展示
六、真核生物的克隆载体
以上主要讨论了原核生物的克隆载体。
但是关于真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工等问题，是原核生物载体所无法解决问题。
因此为了适应真核生物基因工程的需要，现已构建了一系列真核生物载体，主要有以下几大类：
1.酵母质粒载体
酵母质粒载体都是利用其2?
m质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有以下三种（图10-5）：
图10-5酵母质粒载体
（1）附加体质粒（episomalplasmid）
该质粒载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。
此外还有来自酵母2mm质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。
（2）复制质粒（replicatingplasmid）
该质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）。
还有来自酵母染色体的自主复制序列（ARS），以及作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1），故这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。
（3）整合质粒（integratingplasmid）
该质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）。
以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。
这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。
一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
2.真核生物病毒载体
（1）哺乳动物病毒载体
这类病毒载体具有许多突出优点：
例如动物病毒能够有效识别宿主细胞，某些动物病毒载体能高效整合到宿主基因组中，以及高拷贝和强启动子等，有利于真核外源基因的克隆与表达。
目前利用许多哺乳动物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。
（2）昆虫病毒载体
昆虫中的杆状病毒的衍生物作为载体具有许多优点，主要为高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高达100kb；
其次具有高表达效率，外源DNA的表达量达到细胞蛋白质总量的25％左右，甚至更多；
此外，它具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和哺乳动物疾病。
（3）植物病毒载体
一些RNA病毒和DNA病毒已被改造为植物基因工程载体。
目前植物基因工程操作较多使用双链DNA病毒载体，如花椰菜花叶病毒载体。
七、人工染色体
酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。
它是由默里（Murray）于1983年首次构建成功的。
伯克（Burke）等于1987年用以构建成YAC克隆库。
酵母染色体的控制系统主要包括三部分：
①着丝粒（centromere,CEN）它的作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞。
②端粒（telomere,TEL）位于染色体两个末端，它的功能是保护染色体两端，保证染色体的正常复制，防止染色体DNA复制过程中两端序列的丢失。
③酵母自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence,ARS），其功能与酵母细胞复制有关。
酵母人工染色体（图10–7）除有端粒、着丝粒、自主复制序列等外，还有选择标记基因（如TRP1和URA3等）。
图10-7酵母人工染色体（YAC）
YAC克隆外源DNA能力非常大，一个YAC可插入长达100万碱基以上DNA片段。
因此YAC既保证所插入外源基因结构的完整性，又大大减少基因库所要求克隆的数目。
目前YAC已成为构建高等真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。
除酵母人工染色体外，现已构建细菌人工染色体（BAC）更便于基因工程操作，在人类基因组研究中正被广泛应用。
第三节微生物与基因工程工具酶
基因工程操作需要用到一些基本的工具酶。
例如在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。
在构建重组DNA时，需在DNA连接酶的催化下，使目的DNA片段与载体DNA进行连接。
此外，重组DNA技术还需要一些其他的工具酶。
值得注意的是，基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）或简称为限制性酶（restritionenzyme）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。
在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。
1.限制性内切酶的命名与分类
限制性酶的命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。
即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。
如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。
例如EcoRI中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头两个字母，R表示株名，I表示该菌中第一个被分离出来的酶。
如限制酶是来自同一属的细菌，而且种名的头两个字母完全相同，这时其中一个菌的酶命名的第三个字母可用种名的词头后的另一个字母代替。
例如副流感嗜血杆菌（Haemophilusparainfluenzae）的酶表示为HpaI和HpaII；
而副溶血嗜血杆菌（Haemophilusparahaemolyticus）的酶表示为HphI。
根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型，I型和III型由于无切割特异性或特异性不强故不用于基因工程，II型限制酶的限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成，仅需Mg2+作为辅助因子，切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强，用处最大，是基因工程重要工具酶，通常所说的限制性核酸内切酶，即指此类酶。
2.限制性核酸内切酶的基本特性
II型限制酶的识别序列通常由4～8个碱基对组成，他们具有二重旋转对称轴，这些碱基对的序列呈回文结构（palindromicstructure）。
所有限制酶切割DNA后，均产生含5，磷酸基和3，羟基的末端。
限制酶作用所产生的DNA片段有以下两种形式：
（1）形成粘性末端（cohesiveend）
有些限制酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成的DNA限制片段具有粘性末端。
例如HindIII切割结果形成5，单链突出的粘性末端；
而PstI切割结果却形成3¢
单链突出的粘性末端。
（2）形成平末端（bluntend）
有
升级会员 