木质素细菌降解酶的分离筛选与优化Word文档格式.docx
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第一章绪论
1.1本课题的目的、意义
尤其是农作物秸杆正在成为潜在的石化替代燃料，利用秸杆生成乙醇和沼气的技术已逐渐得到应用和发展。
但需通过生物化学或物理预处理方法对秸杆进行处理,以提高沼气或乙醇产率。
木质素的完全降解是由真菌、细菌及微生物群落共同作用的结果，其中真菌的降解研究最为广泛。
细菌降解木质素的能力比真菌差，但是细菌来源广泛、生长迅速，易于大规模应用。
细菌能够产生木质素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶等参与木质素降解的生物催化剂。
通过改性、增溶等作用降解木质素成为低分子量的聚合木素片段。
1.2本课题的研究内容
（1）木质素细菌降解酶的分离方法研究。
（2）木质素细菌降解酶的提纯研究。
（3）木质素细菌降解酶的产酶条件优化。
1.3文献综述
1.3.1木质素的生物降解
木质素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的有机再生资源，同样也是微生物最难降解的成分之一[1]。
影响人们对植物纤维素高效利用的关键问题之一是木质素的阻碍作用。
要突破木质素的束缚，有效利用原料中的纤维素和半纤维素，传统的物理方法能耗过高，污染较大。
所以使得人们越来越倾向于研究木质素生物降解的研究[2]。
卢雪梅[3]等和马登波[4]等对木质素生物降解的反应机制做了综述:
（1）木质素模型化合物的Cα—Cβ断裂。
（2）Cα—氧化机制。
（3）氧的活化。
（4）藜芦醇及其衍生物的活化。
（5）醌/氢醌的形成。
1.3.2木质素降解菌
自然界中，只有少数微生物能够降解木质素。
木质素的完全降解需要通过真菌、细菌等微生物群落的共同作用[5]。
细菌降解木质素的能力与真菌相比较差，但是细菌来源广泛、生长周期短，易于大规模应用[6]。
降解木质素的的霉菌可分为：
白腐霉、褐腐霉、软腐霉。
其中，白腐霉是最主要的木质素降解物。
降解木质素的细菌中，放线菌是公认降解能力较强的细菌，包括链霉菌、节杆菌、小单孢菌、诺卡氏菌等。
另外，还存在厌氧细菌如梭菌，假单胞菌、不动杆菌、杆菌等。
1.3.3国内外研究概况
20世纪50~60年代，证实木材腐朽与细菌有关；
80~90年代，研究表明细菌能够代谢杨木二氧己烷木质素、低分子量的磺化木质素和Kraft木质素[7]片段。
Crawford等[8]，从土壤中分离得到的两株放线菌绿孢链霉菌T7A和西唐氏链霉菌75Vi2可以降解软木、硬木、草类木质素，特别是降解草类木质素的能力很强。
其中绿孢链霉菌八个星期内木质素降解率能够达到19.7%，木质纤维素损失总量可达36.2%。
Lokesh[9]从被糖厂排出物污染的土壤中分离得到的四种细菌：
粘膜炎布兰汉氏球菌，环丝菌，藤黄微球菌，坚强芽孢杆菌。
它们均可以在以引杜林为唯一碳源的固体培养基上生长。
Kukolya[10]从热的马粪便中分离出12种耐热的放线菌，这些菌种可以在以稻草为唯一碳源的培养基中生长，具有不尽相同的木质素增溶能力。
菌种生长所需温度在27℃~67℃。
Gonz·
lez等[11]用新技术从富含木质素的造纸厂废水中筛选出能降解木质素和木质素类芳单体的细菌，并且发现和描述了一种新的细菌属。
陈敏等[12]采用自然筛选、紫外诱变选育和高效筛选技术，从活性污泥中选育高效降解黑液中木质素的优势混合菌。
结果选育得到的混合菌的活性明显高于自然筛选混合菌的活性，更能适应含高浓度木质素的溶液的处理。
Anthony等[13]第一次广泛研究了主要调控因子对绿孢链霉菌产木质素降解酶和聚合物形成的影响，包括氮源、碳源和pH值。
研究结果得出，以酵母膏为氮源替代NH4Cl可以大大增强降解效果；
在pH为8.4-8.8之间，木质纤维素的降解率最高，在酸性条件下适宜木质纤维素的矿化，在碱性条件下增溶能力增强。
罗宇煊等[14]对一嗜碱细菌的营养调控机理做了充分的研究工作，包含氮源、碳氮比、碳源、第一碳源浓度、摇床转速、金属离子浓度等。
研究结果表明，在高氮低碳条件下，细菌的产酶能力较强，加入适量表面活性剂、Mn2+、Cu2+有助于产酶和降解。
1.3.4木质素降解酶及其作用机理
白腐菌的木质素降解酶系是当前木质素微生物降解研究的重点。
一般认为[15]白腐菌主要产生三种木质素降解酶，分别为木质素过氧化物酶（Lip），锰过氧化物酶（Mnp），漆酶（Lac）。
Lip，Mnp，Lac各自代表一系列的同工酶。
Lip[16-18]是一种糖蛋白，分子量约为41000，由一个血红素构成其活性中心，可连接最少一个藜芦醇，木质素大分子不能接近活性中心，但在接近活性中心通道的表面缝隙中，含有一段有序的残糖基，也许是木质素结合点，另外还有两个起稳定结构作用的Ca2+。
木质素降解的启动反应属于单电子氧化，在木质素高聚物生成较稳定的芳香环正离子，充当单电子氧化剂，从而使氧化反应发生在远离酶的位置。
藜芦醇和过氧化氢对Lip降解木质素的反应具有重要作用。
Lip使藜芦醇氧化为正离子，而使得氧化反应扩散，藜芦基醇在此充当单电子氧化的中间媒介物。
过氧化氢是随着木质素酶系的产生而由白腐菌受刺激生成的，即碳源，氮源的短缺促使葡萄糖氧化酶形成的，而葡萄糖氧化酶是产生过氧化氢的主导因素。
因为过氧化氢的形成，Lip降解木质素的反应才能进行。
一般pH为4.5是木质素过氧化物酶引起木质素单电子氧化的关键。
Mnp[16-18]也是一种糖蛋白，分子量约为46000，由一个血红素基和一个Mn2+构成其活性中心，另外还有两个Ca2+起稳定结构作用，其分子中有十条长的，一条短的蛋白质单链。
Mnp在过氧化氢存在时能氧化酚型木质素和木质素模型物，即依靠Mn2+及一种整合物催化木质素发生降解反应。
Mn2+被氧化成Mn3+，Mn3+则反过来氧化酚型化合物，并保护Mnp使其不受到反应活性自由基的破坏。
Lac[19-20]是以O2作电子受体，催化多酚化合物，经四次单电子传递形成醌及自由基的含酮蛋白酶。
一般的漆酶含有四个铜离子，这四个铜离子均位于漆酶的活性部位，在氧化反应中起决定作用。
漆酶催化氧化反应的机理表现在底物自由基的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同配合作用。
当漆酶催化酚类如氢醌氧化时，首先是底物向漆酶转移一对电子，生成半醌一氧自由基中间体。
其次是不均等非酶反应，二分子半醌生成一分子对本醌及一分子氢醌。
氧自由基中间体还原转化成碳自由基中间体，它能够自身结合或相互偶联，产物中有醌，还有聚合物和C-O、C-C偶联产物。
1.3.5微生物产木质素降解酶的影响因素
（1）碳源和氮源
碳源和氮源的来源和营养限制对微生物降解木质素和产酶效果有极大的影响。
有研究表明[21]，木质素本身并非是白腐菌的直接氮源和碳源。
国内在此方面也做了大量研究[22]，结果表明酵母浸汁、牛肉膏等有机氮和酒石酸铵都有利于产酶，其中酒石酸铵的菌丝体产酶效率最高。
吴昆[23]等研究结果显示鼠李糖和阿拉伯糖产Lac的效果好于葡萄糖；
蛋白胨、氯化铵作为氮源对Lac活力最高。
在无机氮中，无氧离子铵盐对Lac产生作用较好。
木质素降解酶都是次生代谢产物，一些白腐菌在限制氮源的情况下，更有利于酶的合成[24]。
（2）温度
微生物产酶也受温度的影响。
有研究[25]称：
P.chrysosporiumINA-12在37℃培养下菌体生长最好，在30℃培养更有利于木质素降解酶的产生。
BrownJ.A等[26]利用NorthernBlot技术，探究突变温度对P.chrysosporium产Mnp的影响后，发现短时的温度刺激可以提升酶的产量，可以在缺少Mn2+的状态下，提高编码Mnp的mRNA。
温度刺激以及Mn2+对Mnp的mRNA的增加有叠加效果。
（3）金属离子
金属离子对微生物产木质素降解酶的影响较为复杂。
越来越多的研究结果表明。
Mn在木质素的降解过程当中起重要作用。
有报道[27]指出Mn2+的浓度和加入时间有关。
每隔24h向培养基加入8.5ppmMn2+,当培养基中没有Mn2+时，Lip酶活力最高；
小于1.66ppm的Mn2+对Lip具一定的促进作用；
当Mn2+超过8ppm时，Lip则完全被抑制。
高浓度的Mn2+强烈抑制限氮条件下培养的P.chrysosporium的Lip酶活力。
另有报道[28]表明MnO2也能提高木质素降解酶活力，使之产酶过程稳定。
余惠生[29]等研究了Cu2+对白腐菌Panusconchatus产木素降解酶的影响。
结果指出，Mnp的产生受Cu2+的影响不是很大，而Lac收到显著的影响。
没有Cu2+的存在，Lac酶活力很低，适中的Cu2+浓度能增大漆酶活性，而过多的Cu2+又会抑制漆酶的产生。
（4）氧气和培养方式
氧气和培养方式也是影响木质素降解酶产生的相关因素。
很多研究[30-31]表明氧气对产生Lip不可或缺.静止培养时，定时通入纯氧有助于促进降解木质素。
珂世省等的研究表明固定化的P.chrysosporium在限制碳的培养条件下，在生长期通入纯氧对Lip的影响不大，无氧不能形Lip或Mnp；
产酶期通入空气能够满足形成Lip的要求，且比限制氮培养条件下得到的Lip还要多。
震荡培养会抑制降解酶的产生，静止培养则不利于大量产酶。
1.3.6木质素降解酶的应用
（1）在造纸行业上的应用[32]
a.生物制浆。
Lac能在常温环境，选择性地降解木质素而不干扰半纤维素和纤维素，可以提高制浆有效得率并且降低造纸成本。
另外，通过漆酶处理的制浆具备良好的抗张强度和平滑度。
b.生物漂白。
通过Lac进行漂白，能减少氯及氯化物和其他化学漂白剂的用量，还能提升纸浆的白度。
Lac介体体系与聚木糖的相互作用能够处理蔗渣硫酸盐浆，可在一定范围上提高纸浆的强度和漂白度。
c.废水处理。
Lac可去除漂白废水所具有的毒性，能催化氯酚生成低聚物，聚合产生的不溶沉淀可以经过沉降和过滤筛除。
（2）环境保护
Lac除了处理造纸业废污水外，还能处理燃料、除草剂、杀菌剂和防腐剂中所含有的酚氯类化合物和苯胺取代物。
Lac也可以进行废水脱色。
另外，固体废物如秸秆，禽畜粪便等，由于含有一定量的木质素，大大拖后了堆肥过程中纤维素的降解速度，而延长了发酵时间。
所以，筛选分离和培育可降解木质素的优良菌剂可提高木质素的降解速度，减短堆肥发酵周期，提升发酵效率。
（3）其他应用
在食品行业中，Lac能够净化饮料、检测食品中的抗坏血酸含量；
以及在食用菌、医用菌制种过程中加快菌丝吃料，发育，从而缩短培育时间；
在饲料工业中，木质素分解酶能够提高动物对饲料的消化率；
Lac还可以用于生物监测；
在免疫检测中，Lac正在被研究代替辣根过氧化物酶，成为新的标记酶。
第二章实验部分
2.1实验仪器
电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；
紫外可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司TV-1810）；
电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司DHG-9123A）；
数显pH计（上海雷磁创益仪器仪表有限公司）；
离心机（常州国华电器有限公司80-3）；
研磨机（德国IKA）；
高压灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司YM-30）；
光照培养箱（上海精宏实验设备有限公司GZP-250）；
冰箱；
摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司ZHW-2102C）；
无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司SW-CT-2F）；
调温电热器（上海平环燃烧设备有限公司）；
数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司HH-4）
2.2实验试剂及材料
三水合磷酸氢二钾（西陇化工股份有限公司）；
七水合硫酸镁（上海美兴化工股份有限公司）；
磷酸二氢钾（南京化学试剂有限公司）；
二水合氯化钙（上海泗联化工厂有限公司）；
硫酸铵（南京化学试剂有限公司）；
酵母膏（上海化学试剂公司）；
氯化钠（南京化学试剂公司）；
秸秆；
L-半胱氨酸（上海慧兴生化试剂有限公司）；
琼脂（国药集团化学试剂有限公司）；
真菌抑制剂-纳他霉素（连云港友进食品添加剂技术开发有限公司）；
ABTS（aladdinindustrialcorporation）；
浓硫酸（南京化学试剂有限公司）；
柠檬酸（国药集团化学试剂有限公司）；
磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司）；
一水合硫酸锰（西陇化工股份有限公司）；
木质素；
氯化铜（上海振欣试剂厂）；
过氧化氢（国药集团化学试剂有限公司）；
2.3木质素降解细菌的分离与纯化
2.3.1菌种土壤的采集
菌种土壤采集自南京紫金山山脚，有大量落叶覆盖，干燥土壤表面下20cm处的土壤。
用塑料袋大致装满，贴好标签，放入冰箱保存。
2.3.2培养基的制备
（1）称量培养基配方（1000mL）
三水合磷酸氢二钾0.2948g；
七水合硫酸镁0.090g；
磷酸二氢钾0.225g；
二水合氯化钙0.030g；
硫酸铵0.225g；
酵母膏0.100g；
氯化钠0.450g；
秸秆粉末15g；
L-半胱氨酸0.5g；
琼脂15g，蒸馏水1000L
（2）高温灭菌
将20个培养皿，5根试管，1支1mL移液管，1支三角刮刀，一个250ml锥形瓶，清洗烘干。
向锥形瓶中倒入90mL蒸馏水，向5根试管里各加入9ml蒸馏水，做好棉花塞后，全部用牛皮纸包扎紧后，放入高压灭菌锅，灭菌3h。
（3）倒平板
取出灭菌后的所有待用仪器于无菌操作台。
向已煮1h，融化并冷却至40℃左右的培养基中加入30mg的真菌抑制剂，充分搅拌后倒入培养皿（约培养皿容积的一半），倒好的培养皿自然冷却凝固。
（4）稀释水样
将锥形瓶和5根试管排列好，按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6依次编号，然后稀释。
（示意图见图2-1）
（5）平板表面涂布
在无菌操作条件下，从浓度小的10-6菌液开始，吸取1mL菌液于相应编号的培养皿内，用三角刮刀在平板上涂布均匀，每个浓度做三到四个平皿，每个皿贴好标签。
涂布完毕，待菌液自然吸收后，将平板倒置，送恒温培养箱37℃培养三天。
（6）筛除非目的平板
培养好的平板，在无菌条件下观察，将不是以细菌生长为主或菌种生长混乱的平板去除，剩余平板则继续培养。
图2-1水样稀释示意图
2.3.3细菌的初步纯种分离
（1）平板的制作
将融化并冷却约至50℃的培养基（配方见2.3.2）倒入培养皿内，使凝固成平板。
（2）平板第一次划线
将新平板在皿底用记号分成4个不同面积的区域，使A〈B〈C〈D，且夹角为120°
左右。
然后取出培养好菌种的平板，在无菌操作条件下挑取少量菌样。
先划A区，然后依次划其余区。
（示意图见图2-2）
图2-2划线示意图
每个一次划线过的平板分别取菌种两次到两个新的平板，将划线后的平板贴上标签纸，写好对应序号。
然后将新平板放置37℃恒温培养箱，倒置培养3天。
良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。
2.3.4细菌的纯种分离
将融化并冷却约至50℃的培养基（配方见2.3.2）倒入培养皿内，使自然冷却凝固成平板。
（2）平板第二次划线
步骤与2.3.4大致相同，划线后的平板贴上标签纸，对应好序号。
用保鲜膜包好，放置37℃恒温培养箱，倒置培养3天。
2.3.5纯种细菌的保种
（1）制作斜面培养基
准备足够的干净的试管，做好棉花塞，排列在试管架上。
准确称量培养基并煮过1h（配方参照2.3.2）后，趁热依次倒入各试管（约占试管1/3），塞好棉花塞，用牛皮纸包好后，用高压灭菌锅灭菌。
（2）斜面接种
将灭菌后的斜面培养基整齐有序地在操作台上摆好斜面，操作台紫外灭菌1h后，斜面培养基自然冷却凝固。
然后进行斜面接种，至接种完毕后，全部试管送37℃恒温培养箱3d。
平板则全部放入冰箱4℃保存。
（3）斜面低温保藏法
待斜面上的菌充分生长后，将所有试管移入冰箱4℃保存。
2.3.6液体接种
（1）制作液体培养基
培养基配方（1000mL）：
，蒸馏水1000mL。
准备10个干净的250mL锥形瓶，做好棉花塞。
将煮过1h后的液体培养基冷却至约40℃，加入真菌抑制剂40mg，充分搅拌。
取100mL液体培养基于第一个锥形瓶，加入1.5g麦粉，塞好棉塞，搅拌剩余的液体培养基。
重复该过程十次，即为1组。
共做4组。
做好后用牛皮纸依个包扎好，高压灭菌3h。
（2）液体接种
无菌环境下，取出冰箱中的纯菌种平板进行液体接种，接种后的液体培养全部贴上对应菌种号码的标签，并送入摇床培养，设置摇床温度30℃，转速160r/min,培养3-4d。
2.4木质素细菌降解酶的研究
2.4.1漆酶（Lac）酶活的测定
Lac酶活的测定原理为Lac分解ABTS的产物为ABTS自由基，然而在波长420nm处，ABTS自由基的吸光系数远大于底物ABTS。
随着ABTS自由基浓度的增加，吸光度值变大。
吸光度值在某一段时间的变化表示为Lac的活力。
采用不同吸光度值变化范围，在某一底物浓度下测定不同稀释倍数时酶液的酶活力，根据酶活力去比那个相应的吸光度值变化范围。
为了增加同一漆酶活力的稳定性以及不同漆酶活力的可比性，测定过程尽量要求测定条件一致。
吸光度变化过程中，ABTS浓度不断降低，产物量却不断增加，因而所测出的吸光度值不断变化。
由于反应时间较快，短暂的时间内，反应迅速，测量时大部分只能捕捉到反应尾声或结束时的底物吸光度，但是漆酶酶活较大的菌种底物浓度相较其他菌种的吸光度较大，所以只需要寻找所测细菌中，在波长420nm处，吸光度较大的细菌菌种即可。
（1）缓冲液的配制
A液：
0.1mol/L柠檬酸溶液1000mL；
B液：
0.1mol/L磷酸氢二钠溶液625mL；
配制好的A、B液混合与2000mL大烧杯中，插入数显pH计，控制添加的A、B液，使pH最终在4-5的范围，装入干净试剂瓶中，贴上标签，保存备用。
（2）ABTS的配置
称取0.0823gABTS（冰箱保存），再加10ml蒸馏水，最终浓度为1mmol/L，充分溶解，装入棕色试剂瓶，贴好标签，避光保存。
（3）移入底物ABTS
取ABTS试剂瓶，用移液枪取200μL于干净试管中，然后再加入缓冲液2780μL。
按此步骤做40个试管，贴好标签，放入恒温水浴锅中，设置温度为30℃。
（4）粗酶液的提取
取出2.3.7中摇床里的所有接种过的液体培养基，在无菌操作条件下，依次取上清液，如取菌28#锥形瓶，将上层清液倒入离心管中，以2500r/min转速离心30min后，用无菌的塑料滴管吸取离心管上层清液于无菌试管中，试管上做好相应的菌种标记如28#。
同一批可以离心6个。
根据实际情况，提取粗酶液的菌号为1#、3#、4#、5#、6#、8#、9#、10#、11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、19-1#、20-1#、20-2#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#。
按上述步骤操作直到取出所有菌种的粗酶液于试管中。
另外做一个空白对照，即不加入酶液，而是缓冲液。
（5）测定
紫外分光光度计设置波长为420nm，设置10s取样一次，共6次。
取空白对照试管校零。
用移液枪吸取粗酶液50μL于对应的底物试管中，启动反应，注意不碰到试管壁，轻微震荡后将试管中溶液倒入比色皿，立即测4min内吸光度。
记录数据。
（6）注意事项
因为实验实际操作和液体培养基的损坏，粗酶液并不是按序号提取的；
水浴时间不超过5min；
ABTS试剂在冰箱里保存；
比色皿在测量后一定要清洗干净。
2.4.2锰过氧化物酶（Mnp）酶活的测定
Mnp酶活力测定原理为二价锰离子是在Mnp作用下，变成三价锰离子，在波长238nm处测三价锰离子的吸光值。
测定锰过氧化物酶酶活的时候，只需分辨出哪些菌种的锰过氧化物酶的酶活较高即可。
此方法可用于连续测定，称为乳酸钠法。
A液
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