拉萨市甘曲湿地土壤真菌的初步分离及鉴定 2汇总文档格式.docx
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甘曲湿地中以矮嵩草为主湿地生态系统，还有其他植物如：
琉璃草、海韭菜、肉果草、绝毛为陵菜、西藏粉报春、马鲜花、嵩草、芦苇、杉叶藻、锦鸡儿、苔草。
从西到东逐步进行采集十个样方，每个样点的土壤的硬度跟植被类型不一样，从西南入口采集地样点四号，是典型的湿地草甸，植被类型有荆刺耳灌木丝、臧松草、蒲公英、绝毛为陵菜以及还有附近村庄的奶牛以及排放的牛粪，所以此样点的植被较丰富。
如样点八号为红色硬土湿地，植被类型有爱嵩草、绝毛为陵菜、蒲公英，样点的植被类型较单一。
当然，土壤中的植被分布不同，在土壤里面生存着的微生物的种类以及数量上有很大的差距，而且土壤的深层不同导致微生物的种类也有很多，有些厌氧性的微生物它就喜欢生存在叫深层，若是需氧型的喜欢生存在土壤的表层。
1.1甘曲湿地的植被类型与海拔以及经纬度
表1甘曲湿地的植被类型与海拔以及经纬度表
样点
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
海拔
3763.8m
3767.3m
3750.5m
3743m
3744.2m
3749.8m
3762.9m
3749.2m
3740.2m
3750.4m
经度
91˚27′64.17"
91˚27′96.87"
91˚28′23.43"
91˚16′24.91"
91˚27′35.73"
91˚27′42.05"
91˚27′06.91"
91˚28′10.35"
91˚28′06.73"
91˚28′36.98"
纬度
29˚89′57.12"
29˚89′57.22"
29˚89′57.43"
29˚53′52.36"
29˚89′78.88"
29˚89′29.47"
29˚90′05.8"
29˚89′75.23"
29˚89′95.85"
29˚89′65.38"
周边环境
土壤松土，有老鼠的洞，植被有绝毛萎陵菜，蒲公英；
琉璃草等。
土壤的湿度很大，周边为田野，植被有点滴梅；
藏粉报春，萎陵菜等
土壤湿度大，靠边村庄；
有乔木蒲公英等
靠近从城镇流过的污染水源，植被有高山嵩草，矮松草，粉报春等
几乎都覆盖着高山矮嵩草的草甸，并且有周边村庄的家畜以及粪便
湿地，牛群聚集植被类型有火龙草，马鲜花；
蕨毛萎陵菜等
土壤水分丰富，植被类型有海韭菜，锦鸡儿，粉报春等
红色泥土，湿度很大；
植被有苔草，蕨毛萎陵菜；
嵩草蒲公英等
浅红色泥土，植被有琉璃草，芦苇，嵩草等
靠近水流，有蕨毛萎陵菜，粉报春，高山嵩草等。
1.2土样采集
2015年秋季，根据甘曲湿地不同土壤类型及植被丰富度等来选取10个样点进行采样。
在每个样地取不同深层的土壤，取样深度10~20cm将采集的土样标记后装在密封的口袋中带回实验室，备用。
1.3培养基
1.3.1马丁氏培养基
制作方法如下：
（1）在1000ml的无菌水中加入36.6g的孟加拉红培养基，放在电磁炉上溶解至沸腾；
（2）迅速把完全溶解好的培养基倒在无菌的三角瓶中分装、包扎、灭菌。
（3）链霉素的加入链霉素受热易分解，所以临用前将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。
先将链霉素配成1%的溶液，在100ml培养基中加1%链霉素0.3ml,使每毫什培养基中含链霉素30μg。
1.3.2真菌的分离和纯化
菌悬液的制备：
分别称取不同样地不同深层的土样1g，分别倒入相应样点标记的含有99ml无菌水的三角瓶中震荡15min,使土样充分打散；
用微量移液器吸取土壤悬浊液1ml倒入9ml无菌水的试管中，即成了10-2的土壤悬液。
：
操作时管尖不能触碰到液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液之后把移液管放回相应的试管中，忌不能混用。
真菌的培养和分离：
倒平板法：
右手拿着盛有培养基的锥形瓶靠与火焰旁，用左手将瓶盖轻轻拔出，用右手小指与无名指夹住瓶塞，瓶口保持对着火焰。
左手中指和无名指托住培养皿底用拇指和食指捏住盖将培养皿在火焰附近打开一个缝隙，迅速倒入培养基（培养基的量以铺盖皿底的1/3），加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀铺在培养皿底部，平置于桌面上，待其凝固后即成为平板。
用微量移液器吸取10-2稀释液0.2mL倒在马丁氏培养基中混匀，并每个样点做了两种对照组，于28℃恒温箱中进行培养3d-5d。
纯化：
斜面接种：
在长好菌的培养皿中用接种针接种的菌在斜面培养基中进行纯化,同样培养3-5d。
1.4真菌的分类鉴定
1.4.1基因组DNA的提取：
参照文献[3-4]方法提取
1.4.2PCR扩增与测序
1.5数据处理
采用EXCEL软件计算真菌多样性指数；
不同样点中真菌总丰度差异性分析采用SPSS19.0的Duncan检验法；
计算不同样点间真菌Jaccard相似性系数。
真菌多样性指数主要包括物种丰富度、真菌总丰度、出现频率、相对丰度、Shannon-Wiener多样性指数（H′）、Pielou均匀度指数（J′）及Simpson多样性指数（D）等。
其中：
物种丰富度指是指测定一定空间范围内的物种数目以表达生物的丰富程度。
真菌总丰度指从某一样方里分离的真菌数量（cfu/g）。
出现频率为某一种真菌出现的样方数占所有样方的百分比。
相对丰度指某一种真菌菌株数占所有真菌菌株数的百分比。
H′＝－Σ（Pi）（lnPi）
J′＝[－Σ（Pi）（lnPi）]/（lnN）
D＝1-Σ（Pi）2
N为某一样方里分离的真菌总株数；
Pi为某一样方第i种真菌菌株数与该样方真菌总株数的比值。
Jaccard相似性系数为两种样方共有的物种数与两种样方真菌物种数的并集的比值。
2结果与分析
2.1甘曲湿地土壤真菌的菌落特征及显微形态
表1甘曲湿地土壤真菌菌落特征及显微形态
菌种
形态特征
显微特征
Aspergillus.sp
白色厚绒状，菌落反面条形折皱，
分生孢子梗由一根直立的菌丝形成，菌丝的末端成球状膨胀（顶囊），在一些种中，顶囊部分或全部的为瓶梗融合层所覆盖，而在大部分种中，顶囊由小梗融合层和瓶梗的融合重叠层覆盖。
每个瓶梗向茎地产生一条球形、有色、不分隔的分生孢子链，根据中的不同，分生孢子可以是黄色、绿色或黑色等。
Neurosporatetrasperma
菌丝体疏松，分生孢子卵圆形，呈橙红色或者粉红色，
具有疏松网状的长菌丝，有隔膜、分枝、多核；
无性繁殖形成分生孢子，一般为卵圆形，在气生菌丝顶部形成分支链，分生孢子呈桔黄色或粉红色，
Asoergillusniger
初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，孢子囊呈球状，背面无色或中央略带黄褐色；
壁厚而光滑，
菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色；
平滑或者粗糙。
对紫外线的耐性强，菌丝发达多分枝，有隔多核的多细胞；
膨大的菌丝细胞上垂直生出；
菌丝、孢子常呈现各种颜色，黑、棕、绿、黄、橙、褐等每菌种不同，颜色各异。
Aspergillusversicolor
菌丝圆形紧密，绒毛状，羊毛状，颜色有数环，从青绿到红绿；
无溶出液，菌落反面无色，中间部分黄棕色，
分生孢子头初为球形，后呈辐射形，顶囊稍长形或稍呈椭圆形，产孢结构双层，分生孢子球。
从表1的真菌形态特征及显微特征来看，菌株在培养基中开始长出到完成过程中有些在颜色上有发生变化，有些无明显变化；
曲霉属与脉胞菌在刚长到后期颜色上没有明显变化。
黑曲霉刚初始的颜色为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，形成孢子囊呈球状，背面无色或中央略带黄褐色；
花斑曲霉为颜色有数环，从青绿到红绿。
表2.2甘曲湿地土壤真菌的分布
表2甘曲湿地土壤真菌的分布
出现频率（%）
相对丰度
（%）
40
22.22
Neurosporatetrasperma
12
30
24.69
16
60
50.62
2.47
从表2中可以得出，Aspergillusniger黑曲霉出现率最高，为60%在甘曲湿地中生存的很普遍，基本上每个样点都有它的存在，其次是Aspergillus.sp曲霉属，占40%；
Neurosporatetrasperma脉胞菌在湿地中出现率为30%，现对于前面两个而言分布不太广泛，Aspergillusversicolor花斑曲霉也叫杂色曲霉出现率最低只有10%此菌分布非常局限，只在3号样点中分布；
从相对丰度上面来分析：
黑曲霉的相对丰度最大，为50.62%在甘曲湿地的十个样方中它的物种数目最多；
其次，黑曲霉属与脉胞菌的相对丰富相差不是很大，它们在数量上较接近相同，相对风度最小的为花斑曲霉，只有2.47%它在十个样方中除了在3号样方之外其余的九个样方中都没生长。
2.3甘曲湿地土壤真菌的Jaccard相似性系数
表3甘曲湿地土壤真菌的Jaccard相似性系数
0.31
0.08
0.19
0.20
0.18
0.22
0.05
0.74
0.25
0.50
0.39
0.13
0.40
0.10
0.32
0.56
0.26
0.30
0.06
计算甘曲湿地土壤真菌的Jaccard相似性系数。
从表3中可以看出，十个样方中的真菌的相似度系数介于0~1之间。
在十个样方中3号样方与8号样方的相似度最高，相似性系数0.74；
其次是2号样方与10号样方，相似性系数为0.56；
样方1号与样方8号，样方2号与样方8号的相似度很低且它们的相似性系数是一样，均为0.05；
4、5、7号样方中均没长真菌因此它们的相似性系数为0。
表2.4甘曲湿地土壤真菌的多样性指数
表4甘曲湿地土壤真菌的多样性指数
丰富度
总丰富度（×
102cfu/g）
Shannon-Wiener多样性指数（H′）
Pielou均匀度指数（J′）
Simpson多样性指数（D）
0.217
0.167
0.320
0.420
0.313
0.582
0.469
0.554
0.653
0.292
0.480
14
0.471
0.383
0.657
表4数据中显示，样点2、3、10号中物种丰富度最高，其次是样点1号跟9号，样点6、8号中只有一种真菌；
剩余的样点4、5、7中根本就没有真菌的生存。
真菌总丰富度中显示，样点1、2号丰富度最高，为30×
102cfu/g；
其次是10号样点，14×
3、9号样点的总丰富度为相同，7×
其余的样点4、5、6、8各样的总丰富度与其前面的样点总丰度相对最低；
采用EXCEL软件分析了真菌多样性指数，数据如表4所示。
Shannon-Wiener多样性指数（H′）、Pielou均匀度指数（J′）及Simpson多样性指数（D）显示，2、3、10号杨点的多样性指数最高即最为丰富，分布也相对均匀，1、9号样点的较低，分布较局限，4、5、6、7、8号样点中的真菌极少。
3结论与讨论
3.1结论
甘曲湿地整个地块分为十个样方，从每个样方中分离到的真菌的类型以及数量上有很大的区别，甚至有个别样方中都没长菌；
可能是在操作过程中疏忽或者秋季昼夜温差大引起的。
通过用PCR扩增技术、DNA提取、16srRNA序列分析，经分离、纯化鉴定出纯化鉴定出两种真菌属和4种真菌；
曲霉属Aspergillus.sp黑曲霉Aspergillusniger花斑曲霉Aspergillusversicolor脉胞菌Neurosporatetrasperma各真菌的分布情况不均一，在表2中显示；
黑曲霉出现率最高，为60%在甘曲湿地中分布很广，曲霉属在土壤、空气、及其各类物品上；
分解有机物的能力很强。
[5]基本上每个样点都有它的存在，曲霉属与脉胞菌在湿地中出现率为较广，花斑曲霉也叫杂色曲霉出现率最低只有10%此菌分布非常局限，只在3号样点中分布。
分布程度上的差异，其一，有可能是微生物所需的营养成分以及水分的的多少有关，其二，也许是本人在实验操作过程造作不当的原因，或者在菌株在培养的时候培养天数不够造成，经资料显示，
3.2讨论
湿地与森林、海洋称为地球三大生态系统，被冠以“地球之肾”的称谓。
它的生物多样性体现在湿地是地球生命的基因库，具有丰富的物种资源，是众多野生动植物特别是珍稀水禽的繁殖和越冬地。
[7]
湿地土壤微生物是生态系统不可缺少的重要组成成分，它在改变土壤的理化性质以及以分解者的角色促进生态系统的物质循环和能量流动中发挥着重要的作用。
真菌广泛分布在各种各样的土壤环境中,由于不同环境因子的影响,土壤真菌在其生活环境中形成独特的群落种类、组成和分布规律。
物种多样性是衡量一定地区生物资源丰富程度的一个客观标志，土壤微生物的物种多样性常用指标有物种丰富度（Richness）、多样性（Diversity）、Shannon-Wiener多样性指数（H′）、Pielou均匀度指数（J′）及Simpson多样性指数（D）最为常用。
[8]
微生物多样性性是指在一定区域内的生活在同一环境下不同微生物种群在组成、结构、功能存在多种差异的表现过程。
土壤中微生物的种类、分布、数量变化很大。
在耕作和施肥的土壤中比荒地以及沙漠化的地方微生物数量上有很大的差别。
在1克肥沃的土壤微生物含量可达1亿以上。
在土壤的表面因为太阳的直射照光与土壤本身的干燥，微生物的数量较少，但是离地面10~20cm的土壤深层中则数量最多。
[9]
土壤真菌是指以土壤为活动场所完成其全部或部分生活史的真菌,包括土壤习居菌和土壤寄居真菌,几乎所有的真菌种类都有可能在土壤中存在在土壤表层约10cm范围内真菌数量最多,约30cm处仍有少量真菌存活。
一般来讲,土壤中真菌的数量和种类随着土壤深度的增加而减少；
真菌包括四大类群:
壶菌门、接合菌门、子囊菌门和担子菌门。
最新研究估计全世界真菌种类约有150万,但至今已被正式描述的只有5%~10%。
[9-10]真菌在自然界中的碳循环与氮循环中起着重要的作用。
位于拉萨林周县的甘曲湿地；
由于城市的扩建和泥炭开采等人为因素对湿地破碎化程度大大增加，导致生态系统处于临界健康状态，从而生存在土壤中的微生物影响极大，使对农业以及湿地本身的功能衰退，最终给人类带来极大的危险。
但是近年来各部门对湿地生态系统的保护重视使极大处于缓慢好转的状态，因此，我们进一步步加强对湿地生态系统的保护，减少人类过度放牧以及破坏活动对湿地造成的危害，进而有效地遏制湿地生态系统的退化。
相比细菌与放线菌的数量真菌数量确实很少,但真菌是土在微生物中起着主导租用，是土壤的资源的制造者,具有分解有机物,为土壤及其植物提供所需的各种养分的功能,是整个生态系统健康的指示物。
据研究表明,真菌多样性与土壤水分、有机物、植被的多样性呈正相关。
真菌在土壤生态系统中发挥着各种程度上的的功能,包括降解纤维素、半纤维素、木质素、胶质,还原氮,溶解磷,金属离子,产生抗生素用于制植物病害等。
全球气候的变化以及环境污染还有人类活动等对真菌的数量、种类和分布收到影响,从而导致自然环境中真菌的种类和数量、分布都发生了显著的变化,真菌多样性研究越来越受到人们的重视,而研究一定区域内土壤真菌的多样性将有助于我们了解该区域生态状况和有益微生物资源。
[11]
参考文献：
[1]西藏启动高原绿色希望工程—湿地保护计划.中国西藏网.2010-09-27
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[3]陈友徐宏家陈勇敢.灵芝大田栽培土壤真菌的初步鉴定.[Ｊ]2013-04-05
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[5]白雪.四川省甘孜州土壤真菌的多样性研究.［Ｊ］.2009-06.
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[8]HawksworthDL,RossmanAY.Wherearealltheundescribedfungi?
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[9]HawksworthDL.Themagnitudeoffungaldiversity:
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