PCR技术详解.docx

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PCR技术详解

PCR技术概论

　　聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DN***段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。

PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史

　　PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：

“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

　　PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。

其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

　　PCR的改进与完善　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：

①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DN***段不均一。

此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。

这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

　　1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DN***段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DN***段。

但每循环一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（thermusaquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶。

此酶具有以下特点：

①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。

②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。

③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度（2.0Kb）。

由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。

为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶（TaqDNAPolymerase）。

此酶的发现使PCR广泛的被应用。

PCR技术的基本原理

　　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　　PCR的反应动力学　PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。

Y代表DN***段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列DN***段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

　　PCR扩增产物　可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。

短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。

进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。

引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。

不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DN***段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

　　 10×扩增缓冲液　10ul

　　　4种dNTP混合物　各200umol/L

　　　引物　　　　　各10～100pmol　

　　　模板DNA　　　　0.1～2ug　

　　TaqDNA聚合酶　2.5u　

　　　Mg2+　　　　　　1.5mmol/L

　　　加双或三蒸水至　100ul

　　PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

　　引物：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

　　①引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

　　②引物扩增跨度：

以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

　　③引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

　　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

　　⑦引物的特异性：

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

　　引物量：

每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

　　酶及其浓度　目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反应约需酶量2。

5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。

dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。

HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。

多次冻融会使dNTP降解。

在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。

浓度过低又会降低PCR产物的产量。

dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

　　模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

SDS的主要功能是：

溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。

提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。

RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

　　温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。

　　①变性温度与时间：

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

　　②退火（复性）温度与时间：

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

　　　　　Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）

　　　　　复性温度=Tm值-（5～10℃）

　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

　　③延伸温度与时间：

TaqDNA聚合酶的生物学活性：

　　　　70～80℃150核苷酸/S/酶分子

　　　　70℃60核苷酸/S/酶分子

　　　　55℃24核苷酸/S/酶分子

　　　　高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的