天然可降解生物材料在组织工程中的应用研究进展Word文档格式.docx
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蛋白质类主要包括胶原纤维蛋白和血纤维蛋白。
1987年，美国国家科学基金会正式提出了组织工程一词。
其基本原理是将体外培养扩增的功能细胞种植于一种生物相容性良好且可被机体吸收的生物材料即细胞培养支架上，形成复合物，然后将此复合物植入机体组织、器官病损部位，以达到修复重建的目的。
细胞培养支架的研究一直是组织工程学的重要研究内容之一。
细胞培养支架是体外细胞获取营养、进行气体交换、废物排泄和生长代谢的场所。
作为细胞培养支架材料应具有以下特点；
（1）良好的生物相容性；
（2）生物可降解性，即可被机体吸收利用或排出体外；
（3）良好的表面活性，有利于功能细胞的贴附、生长；
（4）弱的抗原性；
（5）易加工性，易成型。
当前，在组织工程中开发为细胞培养支架的生物材料主要分为两类，即人工合成的材料和天然生物材料。
天然生物材料具有细胞信号识别，促进细胞的粘附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点，显示出人工合成材料无可比拟的优势。
用于细胞培养支架的天然生物材料主要分为两类：
多糖类和蛋白质类，多糖类主要包括壳多糖、透明质酸及其衍生物等；
蛋白类主要包括胶原纤维蛋白和血纤维蛋白。
天然多糖类
壳多糖（ChitosanCS）
壳多糖是由甲壳素（β-（1-4）聚-2-乙酰氨基-D葡聚糖）脱乙酰基而制得。
竞多糖可溶于稀酸，其分子保留了甲壳素的结构骨架，有氨基和羟基可加以化学修饰。
可制成丝状或膜状等有特殊功能的新材料。
壳多糖具有无毒、生物相容性良好且无抗原性等优点，其降解产物为对人体无毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖。
所以壳多糖是一种较好的细胞培养支架材料。
壳多糖衍生物的研究壳多糖分子问及分子内有强烈的氢键相互作用，使其呈紧密的晶态结构，所以壳多糖只能溶于酸和酸性水溶液，其强度和韧性也明显不足，这就限制了它作为细胞培养支架的广泛应用。
但可通过各种化学修饰制备有良好溶解性的壳多糖衍生物。
壳多糖通过酰基化后，改变了它的晶态结构，改善了其溶解性，同时还使其具有许多特殊的功能，如N-乙酰化壳多糖膜具有较高的抗张强度、渗透性和血液相容性，且在酸碱溶液中较稳定，热分解温度较高，与生物体有较好的亲和性。
这对其作为细胞培养的支架材料的应用具有很大意义。
壳多糖可以进行硫酸酯化、羧甲基化、羟基化等化学修饰，这为壳多糖在细胞培养支架材料中的应用提供了更为广阔的前景。
壳多糖作为细胞培养支架膜材料的性质研究为更好地应用壳多糖作为细胞培养支架材料，必须对不同分子量和脱乙酰度壳多糖的理化指标及吸附性、降解性、安全性等进行研究，同时还需要考虑到制备方法对上述性质的影响。
（1）分子量和脱乙酰度对壳多糖理化指标的影响对不同分子量和脱乙酰度壳多糖膜的指标进行研究，发现随着分子量的增加，膜的抗张强度、伸长强度、吸湿性均会增加。
而脱乙酰度对膜的影响依赖于分子量。
对同一分子量而言，脱乙酰度越高，膜会更脆且不易吸湿。
这说明不同分子量、不同脱乙酰度的壳多糖具有不同的性质。
（2）制备方法方面的研究采用可控制的冷冻和冷冻干燥的方法对壳多糖溶液和凝胶处理，制成孔状、块状、试管状和珠状材料，并对材料的脱水方法进行了研究。
郑化等采用环氧氯丙烷交联制备出壳多糖膜，通过FTIR、XRD、和SEM等表征其结构，并测试了其力学性能。
发现环氧氯丙烷的交联可以提高膜的力学性能、降低溶菌酶的降解速率，这方面的研究为壳多糖在组织工程中作为细胞培养支架的应用提供了基础。
（3）壳多糖材料的生物相容性、降解性、安全性方面的研究采用生理盐水浸泡，紫外线消毒，植入小鼠股部肌肉的方法来研究对不同材料来源的壳多糖膜的组织相容性和降解性进行了研究。
结果发现，60天后壳多糖降解40％，且随着分子量的减小，降解速度加快；
当以蟹壳为原料制的壳多糖时，其膜既无包膜现象，又无炎症反应，表明其生物相容性良好。
通过急性毒性试验、过敏反应、皮肤粘膜刺激反应、热源反应、溶血反应等系列生物学观察，发现由虾壳中得到的壳多糖是一种安全可靠的体内植入材料。
壳多糖在组织工程中作为细胞培养支架的研究早在1985年，Popowicz等将壳多糖溶解于醋酸中，蒸发水分制成一种薄且通透性好的透明多孔膜，并成功用于细胞培养，将已经建立的MDCK细胞系接种在壳多糖膜上，发现细胞能在上面长成单层。
这说明该种膜适合作为细胞生长的支架。
在骨组织工程方面，Klokkevold等研究了壳多糖对体外成骨细胞分化和骨形成的影响，结果表明壳多糖具有促进前成骨细胞分化，加速骨形成的作用。
陈富林等通过体内实验和体外实验相结合的方法研究，发现成骨细胞可在壳多糖膜上较好地贴附和伸展，植入体内后周围组织无明显的炎症反应，未发现组织变性和坏死，并可完全降解，证明它在骨组织工程中是较好的细胞培养支架材料。
在皮肤组织工程方面，将制成壳多糖膜和海绵状的双层结构用于皮肤组织工程中，将人再生胚胎皮成纤维细胞接种在壳多糖海绵上，培养4周后，发现细胞生长增殖良好，成纤维细胞通过新生成的细胞外基质紧密贴附在海绵上，形成活细胞-细胞外基质-壳多糖复合体。
在整个过程中，双层壳多糖材料的形状和大小保持不变。
这说明亮多糖材料在皮肤组织工程中是一种极好的细胞培养支架。
在神经组织工程方面，匡勇等观察几丁质和壳多糖膜对雪旺氏细胞生长的影响，用新生的Wister鼠坐骨神经及臂丛神经的雪旺氏细胞接种于见丁质膜和壳多糖膜上，在培养1、3、7天后发现几丁质和壳多糖膜与雪旺氏细胞有良好的组织相容性，膜上生长的雪旺氏细胞占94％，成纤维细胞占6％，而对照组雪旺氏细胞占71％，成纤维细胞占29％，两种膜均能抑制成纤维细胞的生长。
这说明壳多糖在神经组织工程方面具有广阔的前景。
在软骨组织工程方面，采用软磷脂、多聚赖氨酸和PLA对壳多糖进行包埋后与软骨细胞体外培养，结果证明壳多糖作为组织工程中的细胞培养支架材料具有很好生物相容性和可降解性等一系列优点。
总之，作为一种天然的可降解的生物材料，壳多糖具有良好的组织相容性、可降解性、弱的免疫原性等特点，在组织工程方面具有很大的潜力，此方面的研究已经受到了国内外的重视。
透明质酸（Hyaluronicacid，HA）
透明质酸广泛存在于生物的结缔组织中，1934年，Meyer和Palmer从牛眼中最先分离到此种物质，其相对分子量在10－100万之间，水溶液有很大粘性，在体内可控制细胞和分子的渗透和某些细胞的分化。
由于透明质酸本身是一种天然的细胞外基质，所以作为组织工程中细胞培养支架具有广阔的前景。
透明质酸的羟基可酯化，且能以醛和小蛋白及乙烯砜交联，所生成的交联网络凝胶可作成不同形状和大小的制品。
透明质酸为非抗原性，不会引起炎症和异体反应。
但存在时间和力学性能有限的问题。
在软骨组织工程中，透明质酸分子通过软骨细胞上的膜受体CD44"
锚"
在软骨细胞上，软骨细胞合成的蛋白聚糖单体，通过与细胞外透明质酸作用，形成亲水性的大分子。
Lindenhayn等研究发现，在藻酸盐珠中加入适量的透明质酸，能有效地促进软骨细胞的扩增，因为透明质酸是软骨细胞基质的主要成分之一，在软骨生长和基质形成中起到重要的作用。
Stark等对一种含有激光微孔的透明质酸膜（LaserskinR）进行了研究，结果发现这种薄膜在体外对细胞无毒性，可以有效地作为底物支持表皮细胞的生长。
在特定的培养条件下，保持旺盛的增殖潜能，待达到亚汇合时，可以直接移植到创面上。
所以透明质酸在皮肤组织工程中具有广阔的前景。
但由于透明质酸的溶解性和不易贴附的特点，也限制了它在组织工程中作为细胞培养支架材料的应用。
但对透明质酸进行了交联，再用聚赖氨酸包被，在其上培养雪旺氏细胞，发现聚赖氨酸包被后，雪旺氏细胞的贴附率为350－400cells／mm2，未包被的为0－10cells／mm2，这说明对透明质酸进行交联和表面修饰后，可以作为神经组织工程中细胞培养的支架材料。
蛋白类
胶原蛋白纤维（CollagenousFiber）
胶原蛋白纤维是动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的1／3，是重要的动物细胞外基质成分，可为表皮细胞迁移、增殖铺垫支架，并提供良好的营养，有利于上皮细胞的生长。
故而它在组织工程中应用较多。
胶原支架的安全性通过毒性、无菌程度、溶血性、致热源性的检测以及在两种动物模型中胶原Ⅰ的免疫原性检验，证明是一种可移植的安全且能够支持软骨细胞生长的基质材料。
在骨组织工程中，Ⅰ胶原蛋白纤维通过成骨细胞表面的特异性受体β整合素Ⅱ与成骨细胞紧密结合。
Mizuno等将Ⅰ型胶原用作骨髓基质细胞的培养基质，发现骨髓基质细胞可定向分化为成骨细胞，最终形成含骨髓成分的新生骨组织，并且在此过程中无软骨生成。
胶原蛋白在软骨组织工程中的应用较广泛。
研究证实，采用胶原支架作为模板能够支持软骨细胞的生长及合成基质，生产出大体上组织学和生物特征都与犬半月板相似的软骨。
Orwin等在胶原纤维组成的0.1mm孔的胶原海绵上培养人的角膜上皮细胞、内皮细胞和角质形成细胞，并对上皮和内皮细胞进行组织学和扫描电镜观察。
结果表明，角膜上皮和内皮细胞可以在胶原海绵上扩展并有正常的表型，上皮细胞可受内皮细胞产生的可溶性因子的影响。
这表明胶原可以作为角膜细胞培养的支架材料。
在皮肤组织工程中Horch等用Ⅰ型胶原膜作为支架培养人的角质形成细胞去重建表皮，在没有滋养层细胞和无血清的条件下将角质细胞植入牛的Ⅰ型胶原膜上，待培养到一定条件后植入裸鼠伤口处，结果表明，未交联的牛Ⅰ型胶原膜上的角质细胞可以诱导多层鳞片上皮细胞的重建，有助于伤口的愈合。
血纤维蛋白（Fibrin）
血纤维蛋白凝胶是纤维蛋白单体聚合成，它具有可塑、可粘附和可降解的特性。
这种生物来源的天然生物材料可以作为组织工程中细胞培养的支架材料。
纤维蛋白单体在聚合成凝胶时会释放出血小板来源的生长因子和β转化因子，促进细胞增殖和基质分泌，这种聚合物包埋分离的软骨细胞，可为软骨细胞提供空间支持。
Sims等利用纤维蛋白单体在凝血酶作用下形成凝胶的天然过程制成纤维蛋白凝胶，然后包理软骨细胞作为软骨细胞生长的基质材料。
植入无胸腺小鼠皮下，12周后新生软骨组织为透明软骨，且比较接近正常软骨。
此种新型材料在机械强度、降解时间、材料来源等方面还存在一些问题，这方面的研究正在深入进行。
天然共混材料作为细胞培养支架研究
体内细胞生长的基质非常复杂，且不同的细胞生长基质也不同，所以在组织工程中，不同类型细胞对其培养支架材料的性能要求不同，单一材料较难适应细胞培养的要求，通过共混调整不同材料之间的比例，使共混材料具有更适合细胞培养的力学性能、降解性等性质。
天然可降解生物材料既可以与天然的生物材料共混，也可以与人工合成的生物材料共混。
共混膜材料性质的研究
对胶原-悫多糖共混膜的超微结构，力学性能等方面进行的研究表明，共混膜的性能比单纯壳多糖膜的性能要好，且可以通过改变交联条件如PH、时间和浓度来改变膜的一些性质，这为共混膜在组织工程中的应用提供了基础。
余家会等采用溶液共混的方法制备了壳多糖-明胶共混膜，并采用FTIR、XRD、SEM等方法对该膜的透光率、吸水率和力学性能进行了测试，结果表明，壳多糖与明胶之间有强的相互作用和良好的相容性，壳多糖的加入有利于改善明胶的力学性能。
共混膜材料在组织工程中作为细胞培养支架的应用研究
天然可降解材料与人工合成材料之间的共混用聚乙烯醇PVA／壳多糖混合膜体外培养成纤维细胞，并以扫描电镜观察，发现PVA／壳多糖在成膜过程中其表面及内部空间发生很多变化。
以DSC分析发现PVA和壳多糖这两种多聚物之间相容性不太好；
而用ESCA分析发现其膜表面富集了很多氮原子，这些都反映了PVA膜经壳多糖修饰，可影响混合膜的生物相容性。
以混合膜培养成纤维细胞，用扫描电镜进行形态学分析，并以MTT法计数，发现PVA／壳多糖混合膜比单纯PVA膜更适于细胞生长，且培养于PVA／壳多糖混合膜的细胞与单纯PVA膜细胞相比，能更好地扩散，更平整，更紧凑。
这些结果都表明PVA/壳多糖混合膜可以促进细胞贴附和生长，PVA／壳多糖混合膜将是一种很有前途的细胞培养生物材料。
天然可降解生物材料之间的共混美国Integra生命科学公司开发的IntegraTM人工皮肤已被美国食品及医药管理局（FDA）批准，它的皮层由交联的Ⅰ胶原纤维与硫酸软骨素的多孔网格组成，此网格起生物降解的膜板的作用。
可以引起皮层组织结构再生，胶原-硫酸软骨素还可由戊二醛的交联来调节其降解速度，临床实验确认了IntegraTM人工皮肤的显效性，且在1995年获准进入市场。
EIcin等将壳多糖与胶原、明胶或白蛋白混合制膜，以增强膜的生物亲和性和表面粗糙程度，再在膜上接种大鼠和胎猪的肝细胞，通过两周的培养，发现混合膜适合于肝细胞的贴附和生长，这说明该材料可为细胞生长和形成拟肝细胞提供适当支持。
Tan等对胶原--壳多糖复合细胞外基质在组织工程中的应用进行了研究，对胶原-壳多糖细胞外基质对细胞的形态、分化和功能进行了实验，结果表明，随着亮多糖比例的增加，复合基质的完整性提高，扫描电镜显示壳多糖的添加将会大大地影响复合基质的超微结构，改变胶原纤维的连接方式。
K562细胞培养实验结果显示，虽然随着亮多糖比例的提高，细胞的增殖受到抑制，但是以细胞因子释放为基础的细胞功能却有很大的提高。
这说明胶原-壳多糖材料作为细胞培养的支架具有十分大的潜力。
Sechriest等用壳多糖和硫酸软骨素A混合制得水凝胶，在其中接种上牛的关节软骨细胞，发现细胞能很好地贴附于材料上，并且细胞能保持一些软骨细胞特殊的表型，如细胞呈圆形，有有限的有丝分裂，能生成Ⅱ型胶原及蛋白聚糖等，这些结果证实硫酸软骨素A-壳多糖可能是一种很好的自体软骨移植载体材料或用于组织工程中类软骨组织的骨架。
展望
天然高分子材料来源于生物体本身，具有组织相容性较好，毒性较小，易降解且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点，所以在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势，同时天然生物材料也存在一些需要解决的问题：
（1）天然可降解的生物材料每批产品的质量都不一样，故其产品质量比较难控制，这不利于研究工作的深入。
天然高分子材料在力学性能及降解速度、通透性等方面存在矛盾，即高分子量通常有高强度，但是它的降解速度和通透性就难以满足组织工程中细胞培养支架的要求。
因此，统一材料的质量标准，严格控制其质量，加强材料的性质等基础理论的研究十分必要。
（2）共混生物材料的研究开发，可以取长补短，来满足组织工程中不同组织的要求，但生产出具有合适降解速度、良好通透性、弱免疫原性的细胞培养支架材料。
还需加强对共混膜的性质及制备方法的研究。
（3）对现有天然生物材料，包括其衍生物也有待于进一步的研究开发，如对壳多糖和透明质酸进行化学修饰，产生多种衍生物，使其更适合作为细胞培养的支架材料。
（4）天然可降解生物材料与细胞之间的粘附问题也有待于进一步的研究，选择有利于细胞粘附的材料，同时可以对作为细胞培养支架的材料进行表面修饰，如可将骨形成蛋白（BMP）与壳多糖／PLA混合，然后再作为成骨细胞培养的支架，结果表明此支架材料可以大大提高成骨细胞的分化速度。
（青岛海洋大学生物工程系刘伟治刘万顺孟祥红贺君刘成圣刘晨光）
（中国生物工程杂志）}
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