土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定教案.docx

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土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定教案

土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定

13级生技426

摘要

本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰氏细菌学手册鉴定其种属。

实验中通过80℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。

最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定。

关键词：

淀粉酶芽孢杆菌生化鉴定

一、引言

芽孢杆菌属（Bacillus）是一类好氧或兼性厌氧，产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。

多为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。

由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体。

因此，在工、农业生产上有较高的应用价值。

菌体杆状，直或接近直，0.3–2.2X1.2–7.0微米。

多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子。

在一个孢子囊细胞中，孢子不多于1个。

暴露与空气中时，不妨碍孢子的形成。

革兰氏反应为阳性，仅在生长早期为阳性、阴性。

有机体化能营养，利用多种底物进行严格呼吸代谢，严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。

在呼吸代谢中，最终的电子受体是分子氧，在一些种中可以用硝酸盐代替氧，大多数种产接触酶，严格好养或兼性厌氧。

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制造业淀、粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。

淀粉酶家族包括α-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。

二、实验目的

1．了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；

2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；

3．掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；

4．培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；

5．对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；

6．从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。

三、实验原理

1.淀粉水解试验

细菌分泌到胞外的淀粉酶可以将淀粉水解成糊精、双糖和单糖等，加入碘液后，不出现蓝色反应，菌落周围呈透明圈。

2.VP试验

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物

3.有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚试验阳性。

4．柠檬酸盐利用试验

有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。

此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。

不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。

5.明胶液化试验

有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。

6.耐盐性试验

耐盐性指能耐受高浓度盐类环境而生长发育的性质。

微生物耐盐性试验则是检测微生物的耐盐性。

7.糖发酵试验

微生物具有不同的利用各种碳源的能力，其原理在于不同微生物具有不同的酶系。

绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异。

有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。

溴甲酚紫是一种酸碱指示剂，在中性时为紫色，碱性时为深红色，而在酸性时呈现黄色。

微生物在进行碳源代谢时可以产生不同的代谢产物，有些产物为酸性物质。

酸性物质的积累有时会超出培养基的缓冲范围，导致ph下降，溴甲酚紫的颜色由紫色转为黄色。

在产酸过程中有时会伴随气体的产生，这可以在杜氏管中的气泡反应出来。

若碳源代谢的终产物为中性化合物，既无颜色变化也无气体产生，表明此时的代谢较为复杂。

8.酪素水解试验

微生物酪素水解试验是以天然牛奶蛋白为原料，经酶水解、脱色、脱盐、喷雾干燥而成的产品，含有18种游离氨基酸，含氮和蛋白量均大于80%。

氨基酸是合成蛋白质的基础，是人、动植物、微生物最基本的营养成分之一。

人和微生物可通过蛋白质间接获取氨基酸，但需要胃酸和酶的水解，当蛋白质被盐酸水解成氨基酸组分时药用级可作为能量合剂直接供给人们补充能量。

9.运动性试验

用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。

10.硝酸盐还原试验

有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。

亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。

四、材料与器皿

1.1.材料：

广大生化楼前小河附近（样品1）、B25宿舍附近（样品2）两处的土壤

1.2.培养基

1.2.1.营养琼脂培养基：

采用商业化配方，按照比例，33g/1000mL蒸馏水配制

1.2.2.淀粉牛肉膏蛋白胨培养基（淀粉水解试验）：

在营养琼脂商业化配方的基础上，按照比例，加入2%可溶性淀粉

1.2.3.葡萄糖蛋白胨培养基（VP试验用）：

葡萄糖、蛋白胨、氯化钠各5g、蒸馏水1000mL、pH7.2-7.4

1.2.4.蛋白胨水培养基（吲哚试验用）：

蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL、pH7.2-7.4

1.2.5.西蒙氏柠檬酸盐培养基（柠檬酸盐试验用）：

采用商业化配方，按照比例，33g/1000mL蒸馏水配制，pH7.0,121℃灭菌20min

1.2.6.明胶培养基（明胶液化试验用）牛肉膏3g，蛋白胨10g，明胶120g，蒸馏水1000mL，pH7.0

1.2.7.高盐培养基（耐盐试验用）:

牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl（2g、5g、7g，10g），琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4

1.2.8.糖发酵培养基（糖酵解试验用）:

蛋白胨2g，NaCl5g，K2HPO40.2g，1%溴麝香草酚蓝水溶液3ml，待试糖10g（一般糖或醇按1%量加入，而半乳糖、乳糖按1.5%的量加入），蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4

1.2.9.酪氨酸平板（酪氨酸水解试验用）L－酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，115度灭菌20分钟，然后于100mL无菌的营养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板

1.2.10.酪素平板（酪素水解试验用）取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。

待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板

1.2.11.半固体培养基（运动性实验用）琼脂含量0.5%，其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制

1.2.12.硝酸盐培养基（硝酸盐还原试验用）硝酸钾0.2g、蛋白5g、蒸馏水1000mL、pH7.4、溶解，校正pH，分装试管，每管约5mL、121度灭菌15min

1.2.13.斜面种子培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，pH7.2～7.4

1.2.14.发酵培养基（%）：

玉米粉2%黄豆饼粉1.5%CaCl0.02%MgSO40.02%NaCl0.25%K2HPO40.2%柠檬酸钠0.2%硫酸氨0.075%（溶解后加）Na2HPO40.2%校正pH值7.0

1.3.染料与试剂

草酸铵结晶紫染色液、5%孔雀石绿溶液、石碳酸复红液、路哥尔氏碘液、吲哚试剂、95%乙醇、乙醚、40%NaOH溶液、α-萘酚、香柏油、二甲苯、硝酸盐还原试验试剂:

甲液：

配制磺胺酸冰醋酸溶液,0.8g磺胺酸/100mL冰醋酸;乙液：

配制α－萘胺乙醇溶液,0.5gα－萘胺/100mL乙醇。

1.4.其他器材

无菌玻璃涂棒、无菌吸管、无菌培养皿、试管、接种环、接种针、载玻片、三角瓶、烧杯、洗瓶、玻璃棒、酒精灯、吸水纸、玻璃珠、移液管、移液枪、显微镜超净工作台、水浴箱、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌箱。

五、方法与步骤

1．取样采用5点采样法,在该处1m2内取对角线与对角线交点5点,取表层10cm以下的土壤各200g。

装进无菌防水纸袋,编号,封口

2．初步筛选两个土样分别取10g,分别放入装有90mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶内,塞上棉塞,振荡20min,即为稀释10-1土壤悬浮液。

将2个锥形瓶包扎,利用恒温水浴装置,进行沸水浴100℃加热10min,以杀死悬液中无芽孢的细菌。

再分别另取装有9mL无菌水试管8支,编号10-2,10-3,10-4,10-5和。

振荡混匀已稀释成1-10-1土壤悬液,用无菌移液枪吸取1mL土壤悬液加入编号为10-2的装有无菌水的试管中,并在试管内轻轻反复吹吸数次,使之充分混匀,即成10-2土壤稀释液。

同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为1-10-3的无菌水试管中,混匀后即为1-10-3土壤稀释液,依次连续稀释为10-4,10-5土壤稀释液。

取10-2，10-3,10-4这三个稀释度进行涂布平板操作。

3．制作平板每处土壤,每种稀释度悬液取无菌培养皿2副,共12副，各在培养皿底部贴上标签,注明稀释度。

取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基,无菌操作,倒入无菌培养皿中,冷却,制成平板。

4．涂布平板用一支新的无菌枪头,从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul,对号放入已标记好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上,用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。

每个浓度做2个平板。

于37度温箱中培养24h。

依次分区画线3次。

5．分区划线接种取出最后依次画线的平板,每处土壤选取形态大小颜色边缘形状不一的菌落5个,标记。

分别用接种环以无菌操作挑取之,分别进行分区划线,倒置于37度温箱中培养24h。

6．镜检挑取平板表面单菌落进行单染色,于显微镜下进行镜检,检查获得的菌种是否单一,是否杆菌。

若没获得纯培养,继续进行分区划线,再镜检。

直到获得纯培养。

（判断依据：

菌落的形状、颜色、质地、透明度一致,菌体形态为直杆状,长度均一、宽度一致,并能产生芽孢时,确认为芽孢杆菌属的纯培养物）

6.1．单染色镜检步骤：

涂片、干燥及固定；

染色：

在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液或石炭酸复红液，染1min，倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止。

镜检：

用油镜观察染色结果；

6.2．芽孢染色镜检步骤：

取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌涂片，干燥，固定。

于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。

用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4-5min。

加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

用石炭酸复红液复染lmin，水洗。

制片干燥后用油镜观察。

芽孢呈绿色，菌体红色。

观察芽孢的形状和位置。

7.若镜检后,得知已得到纯培养,则检验该菌种是否产淀粉酶。

筛选产淀粉酶菌株（判断依据：

淀粉水解试验用18-24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂平板（一个平板可分区划“+“字接种），于37℃培养24-48h。

然后将碘试剂完全浸于培养表面。

立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或菌苔周围出现无色透明环。

阴性反应则无透明环）

点接平板选用淀粉牛肉膏培养基,点接已经纯化的芽孢杆菌于平板上,检验是否产淀粉酶。

若产淀粉酶,则将平行组的菌株接种至斜面