小体和PAS整理.docx

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小体和PAS整理

人类X小体的检测

一．实验原理

1.X小体的本质：

哺乳动物体细胞核中，除一条X染色体外，其余的X染色体发生异固缩，功能上处于失活状态，将其称为X小体（X染色质，性染色质，巴氏小体Barrbody），通常位于间期细胞核的核膜边缘，染色深而致密

人类正常的男女体细胞中，22对常染色体并无区别，但其性染色体分别为XY和XX。

女性的两条X染色体中，有一条在间期呈现浓缩状态，可由适当的染料显示。

正常女性口腔黏膜上皮细胞中X小体阳性率10-30%。

2.X小体的数目：

X小体的数目=X染色体数目－1

正常女性细胞：

2条X染色体，X小体的数目为1

正常男性细胞：

1条X染色体，X小体的数目为0。

有三个X染色体者X小体的数目为2

3.莱昂假说（Lyonhypothesis）

（1）正常雌性哺乳动物体细胞中的两个X染色体之一在遗传性状表达上是失活的。

（2）X染色体的失活是随机但恒定的。

失活的X染色体可来源于雌性亲本，也可来源于雄性亲本。

（3）失活现象发生在胚胎发育的早期，一旦出现则从这一细胞分裂增殖而成的体细胞克隆中失活的都是同一来源的染色体

4.剂量补偿（dosagecompensationeffect）

女性有两条X染色体，但所表达的绝大部分遗传物质与只有1个X染色体的男性是一样多的。

这种男女X连锁基因产物相等的现象在遗传学上称为剂量补偿。

5.X小体的应用

（1）鉴定个体的性别

胎儿细胞性染色体检查：

羊水细胞，绒毛细胞，用于预防性染色体遗传性疾病的发生，优生。

（2）诊断性染色体异常综合征

克氏（Klinefelter’s）综合征，先天性睾丸发育不全综合征，患者为男性但有一个巴氏小体，核型是47，XXY。

特纳氏（Turner’s）综合征，先天性卵巢发育不全综合征，患者为女性但却无巴氏小体，核型是45，XO。

超雌：

XXX,XXXY有2个巴氏小体等。

二．实验材料

取材：

女性口腔粘膜上皮细胞

试剂：

0.85%生理盐水，低渗液0.075MKCl，Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶l，现配），5M盐酸，0.2%甲苯胺兰染液

耗材：

牙签、离心管、载玻片、染色缸

仪器：

恒温水浴箱，离心机，光学显微镜

三．实验方法

0.075MKCl

1.取材：

吸取5ml生理盐水于离心管中，漱口后用牙签钝端从口腔两侧颊部刮取女性口腔粘膜上皮细胞4-5次，置入离心管的生理盐水中洗脱下来，轻轻摇匀，1000r/min离心10min，弃上清。

2.低渗：

加入5ml预热的低渗液，轻轻混匀，37℃低渗10min。

甲醇∶冰乙酸＝3∶l，现配

（低渗液的作用：

低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态）

3.固定：

终止KCl进一步低渗

（1）加入新鲜配制的Carnoy固定液1ml，混匀，室温预固定2min，1000r/min离心8min，弃上清

（2）加入固定液5ml，吹打混匀，室温固定15min，1000r/min离心10min，弃上清。

（3）加入固定液0.5-1ml，混匀，制成细胞悬液。

（固定液的作用：

固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，使蛋白凝固，终止细胞代谢过程，并保持细胞核染色体结构的完整性，并且能够增强染色体的嗜碱性，达到优良的染色效果。

）

4.滴片：

吸取细胞悬液自10—20cm高垂直向下滴在一张预冷的载玻片上（2-3滴），标记，空气风干或烘干。

（目的：

从高处向下滴片，让液体分散开：

形成细胞单层，使染色体分散，便于

观察。

用冰片：

是降低液体的表面张力。

）

课件上是细胞壁，我觉得应该是细胞膜

5.水解：

玻片放入盐酸缸中，室温水解10min后取出，自来水细水漂洗数秒钟，洗去多余盐酸，空气风干或烘干。

（水解可除去细胞间的果胶质，使细胞壁软化或部分分解，从而使细胞和染色体易于分散，同时可去除杂质。

）

6.染色：

玻片放入甲苯胺兰染液缸中，染色3min后取出，自来水细水漂洗数秒钟，空气风干或烘干。

（甲苯胺兰是一种碱性染料，与细胞核蛋白（酸性）结合，染成紫蓝）

7.镜检：

低倍镜→高倍镜。

四．注意事项

1.取材前需用水漱口数次，尽可能除去细菌和食物残渣；用洁净的牙签钝端从口腔两侧颊部刮取粘膜，为防止后面的离心损耗，应尽量多取一些。

2.弃上清时，用吸管吸取上清，弃去，接近下方沉淀时，应小心吸取。

3.加入低渗液后，轻轻混匀，不能太用力，以防核膜破裂。

4.固定液使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果。

5.载玻片于临用前在-20度冰箱中取出，现用现取，以防温度上升。

6.加热时应距离外焰一段距离（2-3cm），且来回摆动，以防过热引起断裂。

五．实验结果

1.实验结果的观察：

低倍镜：

选择轮廓清楚，不重叠，染色清晰，核膜完整，核质中颗粒均匀的细胞，观察到细胞核后转到高倍镜下观察。

高倍镜：

观察X小体，大小约为1μm，扁平状、椭圆形或三角形，浓染，紧贴于细胞核核膜边缘。

2.X小体的形状：

3.X小体的阳性率：

正常女性口腔粘膜上皮细胞中X小体阳性率约10%～30%

男性偶尔可见，阳性率＜2%，且形态不典型。

糖原的显色——PAS反应（PPT内容）

石蜡切片法：

以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将标本切成薄片，经一系列处理制成永久切片

是组织学常规制片技术中应用最广泛的一种方法

制作过程：

1.取材→2.固定→3.洗涤→4.脱水→5.透明→6.浸蜡→7.包埋→8.切片→9.贴片→10.脱蜡复水→11.染色→12.脱水→13.透明→14.封片。

（脱水的方法？

透明所用的试剂？

脱蜡复水的方法？

HE染色原理？

）

取材：

从人或动物体内取下所需组织或器官，材料必须新鲜，组织块不宜太大，以便固定剂穿透。

固定：

目的：

迅速凝固蛋白质，终止细胞一切代谢过程，防止组织自溶，保持其活体时结构。

固定剂：

10%甲醛、80%酒精、混合固定剂（Bouin氏液、FAA液、Carnoy氏液）。

用量：

必须充足，一般为材料块的20~30倍。

固定时间：

数小时至24小时。

洗涤：

目的：

除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响后面的染色效果。

方法：

多数用流水冲洗，少数用酒精。

脱水：

目的：

固定或洗涤后的组织内充满水分，而水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去，才能进行石蜡包埋。

脱水剂：

酒精

方法：

从低浓度到高浓度梯度酒精脱水：

30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%各级酒精中放置1～数小时。

水酒精石蜡

透明：

目的：

酒精与石蜡不相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。

组织在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，因此该过程称透明。

透明剂：

二甲苯。

方法：

酒精二甲苯等量混合液（1：

1）15分钟，二甲苯30分钟。

水→酒精→二甲苯→石蜡

浸蜡：

目的：

除去组织中的透明剂，使石蜡渗透到组织内部，达到饱和程度以便包埋。

方法：

石蜡二甲苯等量混合15分钟，石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ各30分钟。

浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内（石蜡的熔点在50~60℃之间）。

包埋：

目的：

将浸蜡后的组织块包埋于石蜡中。

方法：

取出组织块，置于盛有融化石蜡的包埋框中，迅速放入冷水中冷却，待石蜡完全凝固（约30min）后取出，即做成含有组织块的蜡块标本。

切片：

将蜡块装在切片机上，调整所需的切片厚度（4~10um），进行切片，切出一片接一片的蜡带，用刀片割开蜡带。

贴片：

目的：

借助粘附剂将展平的蜡片粘附于载玻片上，以免在以后的操作步骤中脱落。

方法：

在洁净的载玻片上涂抹薄层粘附剂（如多聚赖氨酸），滴两滴蒸馏水于载玻片上，把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，将载玻片放入温箱中干燥。

脱蜡复水：

目的：

染色液多数为水溶液，因此染色前必须将组织中的蜡脱去，才能进行染色。

方法：

与脱水浸蜡过程正好相反：

二甲苯Ⅰ、Ⅱ30min→100%酒精→90%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸馏水各2min。

石蜡→二甲苯→酒精→水

染色：

目的：

使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。

经典的HE染色法：

苏木精（Hematoxylin）伊红（Eosin）

↓↓

碱性染料酸性染料

↓↓

细胞核中的DNA、RNA等细胞质、膜性结构等

嗜碱性物质（本身酸性）嗜酸性物质（本身碱性）

↓↓

染成蓝色染成红色

脱水透明封片:

目的：

去除水分，透明组织，便于观察和长期保存标本。

方法：

脱水：

95%酒精2分钟→100%酒精2分钟

透明：

二甲苯I2分钟→二甲苯II2分钟

封片：

将载玻片从二甲苯中取出放在吸水纸，迅速地在切片的中间滴一滴中性树胶，拿起盖玻片，缓慢倾斜放下，避免产生气泡。

其他制片技术：

涂片（血涂片）铺片（肠系膜可用）磨片（骨）

石蜡切片与冷冻切片：

石蜡切片的制作相对比较复杂，而冷冻切片的制作相对简单，快。

但是石蜡切片可以永久保存，而冷冻切片则不能。

在考虑用哪一种方法时要看取材容不容易，是否保留等问题。

组织化学技术（histochemistry）应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成分，并进行定位、定量及相关功能研究的一种实验技术。

免疫组织化学（immunohistochemistry）

利用抗原（antigen,Ag），抗体（antibody）特异结合的原理，用已知抗体检测未知抗原的一种方法。

（标记物为荧光素、过氧化物酶或金颗粒）

过碘酸-Schiff反应（periodicacidSchiffreaction,PAS反应）

原理：

PAS反应是经典的组织化学方法，用来显示组织细胞中的多糖或糖蛋白。

原理是含有乙二醇基的糖类，在过碘酸的作用下，经氧化而产生双醛基，醛基进而与亚硫酸品红（Schiff试剂）结合，使无色液体变成紫红色染料，并沉着于含有多糖或糖蛋白的细胞或组织结构上。

PA（过碘酸）Schiff试剂（亚硫酸品红）

乙二醇醛基紫红色沉淀（PAS阳性反应）

氧化

应用：

可根据紫红色的位置及深浅鉴定糖成分的分布及相对含量，用于心血管疾病、糖尿病以及某些肿瘤的诊断和研究

PAS染色的方法

1.脱蜡，石蜡切片于染色前经二甲苯脱蜡30min

2.复水，在浓度逐级降低的酒精内分别停留数分钟（100%90%80%70%）

3.过碘酸氧化10分钟

4.蒸馏水洗3分钟

5.Schiff试剂避光染色10分钟

6.0.5%偏重亚硫酸钠溶液浸洗3次（I、II、III），每次2分钟

7.自来水洗3次，每次1分钟，蒸馏水洗1分钟

8.苏木精染色1分30秒

9.自来水洗3次，每次1分钟，蒸馏水洗1分钟

10.梯度脱水：

95%酒精2分钟→100%酒精2分钟，

透明：

二甲苯I2分钟→二甲苯II2分钟

11.中性树胶封片，显微镜下观察（低倍镜→高倍镜）

（结果：

糖原颗粒被Schiff试剂染色呈紫红色，细胞核被苏木精染色呈蓝色，其他背景呈淡粉红色）

观察的标本：

肝和肺：

脾+，肝+++（PAS染色不仅对多糖染色，而且对糖蛋白也染色，脾有少量糖蛋白，呈弱阳性。

而肝是糖类合成的部位，因此阳性强，且在肝血管周围呈放射状分布）

肠道杆菌、霍乱弧菌、3种厌氧菌

一.肥达反应

原理：

用已知伤寒沙门菌O、H抗原，以及引起副伤寒的甲型、乙型副伤寒沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清作定量凝集试验，测定受检血清中有无相应的抗体及其效价的试验。

用于辅助诊断伤寒和副伤寒

（H抗原：

鞭毛蛋白，不稳定。

O抗原：

LPS成分，稳定）

方法：

倍比稀释法：

123456

生理盐水0.50.50.50.50.50.5

血清0.5（吹打）0.50.50.50.50.5（