蛋白质A的表达制备及鉴定Word格式文档下载.docx

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其天然结构十分稳定，在应用6mol／L鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构[1]。

1.1.3SPA的生物活性

SPA能与血清IgG起反应，作用部位是IgGFc段而不是Fab段，认为IgG与SPA的结合是非特异性的“假免疫反应”，这种结合不会影响抗体的活性。

现己表明SPA除与人血清中的IgG结合外还能与豚鼠、小白鼠、狍、猪、貂、猴，北极熊等动物血清中的IgG结合，其中与猪的IgG结合力最强，与大白鼠、羊、鸡、刺猬、鱼类、两栖类及大部分鸟类等动物血清中的IgG不结合。

SPA除与IgG结合还能与IgA2，和IgM反应，SPA与IgM的结合区位于互补决定区及开放读码框架，D结构域与其他结构域比较对IgM及IgA亲和力较高。

另外SPA是一种B细胞激活剂，具有对B淋巴细胞促有丝分裂作用，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助，可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。

由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。

因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。

引起豚鼠离体回肠产生类似过敏反应样的收缩和家鼠局部过敏样坏死，有研究显示SPA与鼠类的脓毒性关节炎有关刺激机体免疫反应刺激人体角膜细胞使其NF．1cB活化和细胞因子TNF-aand1I_,-8时间依赖性分泌，能剂量依赖性的刺激淋巴细胞分泌IgM抗体向lgG抗体的转化[2、3]。

1.1.4SPA的应用

SPA研基于SPA与IgG的Fc段的结合能力，自70年代开始，国外应用SPA建立了许多敏感、特异性强、快速和简易的实验方法，SPA在免疫学、微生物学等领域得到了广泛应用，并在许多方面的应用中积累了实际应用的材料，现已广泛应用到免疫学及其相关科学如细胞学、细菌学和病毒学等。

1．作为广谱第二抗体由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合，因此，作为第二抗体或标记抗体，SPA的最大优点是不受种属特异性的限制；

2．用来纯化免疫球蛋白由于SPA与IgG及其某些亚型的Fc段有较强的结合力，可利用来提纯、分析免疫球蛋白制剂，结合后的PSA．IgG可再用解离剂如4mol／L尿素、4mol／L，硫氰酸盐或6mol／L的鸟嘌呤盐酸盐使之解离.大量研究表明SPA是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的试剂[3]。

3．应用于免疫细胞化学由于SPA具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体，同样，于SPA能与多种动物的IgG的FC段结合，不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中也已得到广泛的应用。

SPA分子量小（13000-42000），易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为200000，PAP复合物为430000，均较SPA分子量大。

4．可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig的固相吸附剂。

SPA用于细胞膜抗原、表面IgG和Fc受体的研究最大特点是能研究活细菌。

已得到愈来愈广泛的应用，是一种较为理想的免疫电镜技术。

5．其它方面随着基因工程技术的发展，蛋白表达提出了越来越高的要求，将蛋白分泌到宿主菌体外能显著降低菌体蛋白酶对异源蛋白的影响，也降低了异源蛋白高效表达时容易出现包涵体的现象，人们将SPA的锚定序列构建入表达载体与异源蛋白进行融合表达，使其能展示在菌体表面或分泌到培养基中，这样还方便了蛋白纯化。

正是由于SPA的众多特点及广泛应用，目前基因工程蛋白也有了大量研究，随着基因工程技术的发展，SPA必将在免疫学、微生物学、基因工程等领域得到越来越广泛的应用[4、5]。

1.2实验相关原理

1.2.1外源基因的表达

将培养过夜的金黄色葡萄球菌体重悬后,采用蛋白酶K和SDSTris缓冲液充分裂解菌体；

经饱和酚抽提水相蛋白,于预冷的无水乙醇沉淀基因组DNA,最后保存于灭菌的去离子水中；

经PCR扩增。

回收PCR产物与载体用BamHI和HindIII消化表达载体,加T4DNA连接酶于4℃连接过夜。

连接产物转化为感受态大肠杆菌DH5α[7]。

1.2.2SDS-PAGE检测表达的蛋白质

蛋白质分子是两性电解质分子，在直流电场内可以移动，PAGE过程中具有三种物理效应：

（1）凝胶对样品分子的筛选效应（分子筛效应）

颗粒小、呈球形的样品分子移动快，颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶孔洞时的阻力大，移动慢。

（2）不连续系统对样品的浓缩效应

凝胶层的不连续：

浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小，在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时的阻力小，移动快，而在小孔径中，移动慢。

因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

缓冲液离子成分及pH的不连续：

在两层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷（Tris）及HCI。

Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子，HCI在任何pH值溶液中均易解离出氯离子，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。

电极缓冲液中的甘氨酸（Gly）在pH8.3的缓冲液中其解离度很小，仅为0.1％－1％，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。

血清中，大多数蛋白质等电点在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷，在电场中移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面出，被浓缩成极窄的区带。

三者的有效迁移率为m氯α氯>

m蛋白α蛋白>

m甘α甘（m为迁移率，α为解离度），当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子及甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。

蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分成多个区带，因此分离胶之间pH的不连续性可控制其迁移率。

在浓缩胶中要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品在快慢界面之间被浓缩。

进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。

电位梯度的不连续性：

电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关。

电泳开始后由于快离子迁移率大，就会很快超过蛋白质，在快离子后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区。

低的电导区就具有较高的电位梯度，而高的电位梯度又使蛋白质和慢离子在快离子后面加速泳动。

当三者的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，三者的泳动速度就相等。

在快慢离子的移动速度相等的文台建立后，二者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。

而蛋白质的有效迁移率在快慢离子之间，因此也就聚集在这个移动附近，被压缩成一个狭小的中间层。

（3）电荷效应

当进入pH8.9的分离胶后，各种血清蛋白质所带静电荷不同，而有不同的迁移率。

表面电荷越多，则迁移快；

反之则慢。

因此各种蛋白质按电荷少，分子量大小及分子形状以一定的顺序排列形成一个个区带。

不连续聚丙烯酰胺凝胶系统所具备的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应大大提高了它的分辨率。

1.2.3Westernblotting

Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、材料与方法

2.1材料

2.1.1表达载体与抗体

大肠杆菌DH5α、一抗（BSA）、酶标二抗

2.1.2主要仪器

高速离心机（D-37520，OsterodaamHarz）

电子天平（JY2002，上海衡平仪器仪表厂）

分析天平（AUY120,SHIMADZU）

数显鼓风干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）

MJ-300BS-Ⅱ霉菌培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）

超速离心机（D-78532Tuttlingen，Hettich）

恒温振荡器（CHA-S，国华企业）

稳压稳流电泳仪（JY-600PJ，北京君意东方）

调速多用振荡器（HY-4，国华电器有限公司）

TY92-II超声波细胞破碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）

洁净工作台（等级：

100级，上海博迅实业有限公司医疗设备）

美的电冰箱（美的集团电冰箱制造有限公司）

2.1.3主要药品和溶液

2.1.2.1SPA基因的诱导表达

1、5×

M9盐溶液（V=100ml）：

在去离子水中溶解以下盐类，终体积为100ml。

Na2H2PO4·

12H2O8.55g

KH2PO41.5g

NaCl0.25g

（NH4）Cl0.5g

2、LB培养基（固体培养基加1g琼脂）：

在去离子水中溶解以下物质，终体积为100ml。

胰蛋白胨1g

酵母提取液0.5g

NaCl1g

3、M9培养基：

在750ml无菌水中（冷却至50℃以下）加入下表试剂

5*M9盐溶液200ml

1mol/LMgSO42ml

1mol/LCaCl20.1ml

20%葡萄糖（细菌滤器除菌）20ml

2.1.2.2SDS-PAGE

1、2MTris-HCL（pH8.8）,100mL

称取24.2gTris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4mL），让溶液冷却至室温，pH将会升高。

加蒸馏水至100mL。

2、1MTris-HCL（pH6.8）,100mL

称取12.1gTris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8mL），让溶液冷却至室温，pH将会升高。

3、10％（W/V）SDS,100mL

称取10g的SDS,加蒸馏水至总量100mL

4、50％（V/V）甘油，100mL

量取50mL100％的甘油，加入50mL蒸馏水。

5、1％（W/V）溴酚蓝，100mL

称取100mg溴酚蓝加蒸馏水至100mL，搅拌直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。

6、A液：

丙稀酰胺储存液，100mL

30％（W/V）丙稀酰胺，0.8％（W/V）双丙稀酰胺。

称取29.2g丙稀酰胺和0.8g双丙稀酰胺加水至100mL

7、B液:

4×

分离胶缓冲液，100mL

75mL2MTris-HCL（pH8.8）1.5M/L

4mL10％SDS0.4％

21mL蒸馏水

8、C液：

50mL1MTris-HCL（pH6.8）0.5M/L

46mL蒸馏水

9、10％过硫酸铵，5mL

0.5g过硫酸铵加到5mL蒸馏水,可在密封管内，4℃存放数月。

10、电泳缓冲液，1L

3gTris碱25mM

14.4g甘氨酸192mM

1gSDS0.1%

加蒸馏水至1L，pH应该在8.3左右。

11、5×

样品缓冲液，10mL

0.6mL1MTris-HCL（pH6.8）60mM/L

50％（V/V）甘油25%

2mL10％SDS2％

0.5mL2-巯基乙醇14.4mM/L

1mL1％溴酚蓝0.1％

0.9mL蒸馏水

可在4℃存放数周，或在－20℃保存数月。

12、12％分离胶

A液4mL

B液2.5mL

蒸馏水3.5mL

10％过硫酸铵50µ

L

TEMED5µ

总量10mL

13、两块5％堆积胶（6cm×

8cm×

0.75cm），4ml

蒸馏水2.3ml

A液0.67ml

C液1.0ml

10％过硫酸铵30µ

14、考马斯亮蓝染液，1L（过滤）

考马斯亮蓝R－2501.0g

甲醇450mL

蒸馏水450mL

冰醋酸100mL

15、考马斯亮蓝脱色液，1L

甲醇100mL

冰醋酸100mL

蒸馏水800mL

16、标准蛋白marker

2.1.2.3Westernblotting

1、转移缓冲液，500ml

水300ml

Tris1.5015g

Gly7.205g

甲醇100ml

加水定容到500ml

2、PBS缓冲液（pH7.4），250ml

水200ml

NaCl2g

KCl0.05g

Na2HPO4•12H2O0.908g

KH2PO40.06g

用HCl调pH至7.4，加水定容到250ml

3、封闭液，100ml，现配现用

5%脱脂奶粉

0.2%Tween-20的PBS缓冲液

4、洗涤液，500ml

0.2%Tween-20的PBS缓冲液

5、抗体稀释液（同封闭液）

6、显色剂

DAB（二甲基联苯胺）16mg

30%H2O280ul

加0.01mol/LTris-Hcl（pH7.2）至总体积20ml，新鲜配制

2.2方法

划平板、挑单菌落及小摇过夜（LB-Amp+培养基）

↓20：

1

扩大培养（M9-Amp+培养基）

↓IPIG、15℃

诱导培养

↓

离心收菌

破碎细胞

↓超声波

SPA的提取

SPA的检测、鉴定

2.1.1SPA的表达

1、配置M9培养基和LB培养基

2、取重组菌，划平板（LB-Amp+培养基），获取单菌落。

3、挑取单菌落于试管（5mlLB-Amp+培养基）中，37℃震荡（小摇）过夜。

4、第二天扩大培养，将5ml的菌液接种于100mlM9-Amp+培养基的锥形瓶中，在37℃，150rpm振荡的条件下扩大培养。

5、将扩大培养的菌种冰浴5分钟，在15℃，2000rpm的条件下振荡培养45分钟，然后再加入IPTG（终浓度0.8mmol/L）诱导，在15℃，200rpm的条件下振荡培养4天。

6、将上述培养液4℃，8000r/min离心20min取沉淀，4℃贮藏备用。

2.1.2SPA的提取

1、取经扩大培养的样品A11mL置于EP管中，4℃，12000r/min离心10min收集细菌沉淀，弃去上清；

向沉淀中加入400μL水和100μ5×

SDS凝胶加样缓冲液，重悬后煮沸10min，离心8min，取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

2、取经诱导培养的样品A21mL置于EP管中，4℃，12000r/min离心5min收集细菌沉淀，弃去上清；

向沉淀中加入400μL水和100μL5×

SDS凝胶加样缓冲液，重悬后煮沸10min，离心8min，取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

2.1.3破细胞收菌

1、将收集的菌体沉淀加20ml破碎缓冲液（pH8.0的lys缓冲液）在冰上混合45分钟，如果pH7-8，需要用0.5MNaOH一边搅拌一边滴加.

2、把混合菌体在冰水中用超声探头破碎3min,检测pH,如果不在7-8,还是用0.5MNaOH一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1升,破碎三次,压力为800bar.

3、破碎的液4度12000g离心20分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去提取。

2.1.4SDS-PSGE检测表达的蛋白质

1、制备分离胶和堆积胶，依次缓慢倒入模具中，将梳子插入凝胶中，带凝胶聚合，小心拔出，将凝胶放入电泳槽中，接好电极，把电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶没入缓冲液中。

3、取蛋白质样品和5×

样品缓冲液混合置于EP管，100℃水浴10分钟，离心取上清液。

（包括诱导前A1、诱导后A2、标准蛋白、上样缓冲液）

4、用移液枪把样液加入样品空中，把蛋白质样品加入样品孔的底部，同时加入标准蛋白。

5、打开开关，开始电泳，将电压调制120v，条带经过分离胶时调制150v，溴酚蓝流至底部时关闭电源。

6、取出凝胶，用小刀切去堆积胶。

7、戴上手套将凝胶移到大的培养皿中，倒入适量的染色液，置于摇床上震荡40分钟左右后，弃去染液，在水中漂洗，加入考马斯亮蓝脱色夜，震荡过夜。

2.1.5Westernblottong

1、制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

2、跑胶完毕后用小刀切胶条合适大小，用去离子水漂洗，用转膜缓冲液平衡5分钟，平衡三次。

3、裁好与胶条形状吻合的滤纸，海绵和NC膜没入转膜缓冲液30分钟。

4、按负极碳板、海绵、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵、阳极碳板的顺序放好，用玻璃棒滚动去除气泡。

合拢转移夹板并将平板两侧锁住。

5、开通电源，将电压调至150V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。

6、关闭电源，取出膜，用50mlPBST漂洗十分钟。

7、在37℃下封闭三小时，倒出封闭液，用PBST漂洗三次，每次十分钟。

8、与多克隆抗体反应，37℃振荡2h，抗体稀释比例1:

40，用PBST漂洗3次，每次10min。

9、与酶标二抗反应，37℃振荡10min，抗体稀释比例为1:

200，用PBST漂洗3次，每次10分钟。

10、放入显色液，看到变色即刻拿出。

11、蒸馏水漂洗，终止反应。

三、实验结果与讨论

3.1实验结果

3.1.1SDS-PAGE检测表达的蛋白质

图3-1第一次电泳带

3.2.2westernblotting

将诱导后的A2经电泳形成的凝胶切下转移到NC膜上，将剩余的Marker蛋白，样品A2及电泳缓冲液、转移后的电泳带做成像处理。

得到SDS-PAGE电泳带（图3-3）、转膜后的电泳带（图3-4）、NC膜显色带（图3-2）

Marker蛋白A2

SPA→←A2处的表达←已转膜

图3-2westernblotting图3-3SDS-PAGE电泳带图3-4转膜后的电泳带

3.2结果分析

3.2.1SDS-PAGE的分析

1、在31.0KD－43.0KD间A1和A2在同一直线上都有清晰的条带（图3－1如下箭头所释）。

且A2的条带较A1深，这说明了IPTG产生作用，在一定程度上起到了诱导的作用，使菌体对该蛋白的表达量增加。

2、诱导后的条带A2与诱导前的条带A1在31.0KD－43.0KD间有处于一条水平线上的电泳条带（图3-1），据文献可判断实验菌产生一种分子量跟SPA一样的蛋白质。

初步猜测此处蛋白质为SPA，为进一步说明，做westernblotting实验来验证。

3.2.2westernblotting的分析

1、SDS-PAGE电泳带（图3-3）经凝胶成像可清晰看到样品A2产生一种分子量跟SPA一样的蛋白质。

2、转膜后的电泳带（图3-4）经凝胶成像后无条带，说明在SDS-PAGE电泳带的A2条带上的蛋白质已完全转移到NC膜上。

3、NC膜经免疫印迹处理（一抗稀释比例1:

40、酶标二抗稀释比例1:

200），显色后清晰的出现了一条棕色条带。

4、比较图3-2、图3-3、图3-4在同一直线上的成像，综合以上分析可知：

诱导后的蛋白质条带与NC膜上免疫印迹之后的结果条带相平齐，且在转膜后的电泳带的同一位置上无条带，由此验证了该蛋白质就是SPA，SPA基因已在大肠杆菌中得到成功表达。

3.2.3综述

由以上可知：

SPA基因在大肠杆菌表达系统中表达出了金黄色葡萄球菌蛋白A，诱导剂IPTG有明显的诱导作用，经试验SPA的提取、制备及鉴定得到证实。

3.3实验讨论

3.3.1SDS-PAGE的讨论

由图3-1中的结果可以看出：

1、可看出标准蛋白、诱导前、诱导后的凝胶条带基本清晰可见，

2、标准蛋白理应只有六条清晰的条带，但是据图像上看，只能较为清晰的看到五条，而且在97.6-66.2KD及66.2-43.0KD之间有比较淡的条带。

推测原因.：

①丙烯酰胺凝胶的聚合，通常是由化学过程完成的，丙烯酰胺的聚合的催化是过硫酸铵和TEMED，合适的催化系统必须不改变凝胶的缓冲条件，黏度和导电性，过硫酸铵和TEMED过量会引起电泳时的烧胶盒蛋白电泳带的畸变，合适的配方使聚合过程要在较快时间内完成；

②在凝胶制成将封条撕掉时，可能造成了凝胶的局部微小移动，在后期的跑胶时影响蛋白质的通路。

窗体底端

3、实验注意问题：

①注意每次使用完电泳槽后都要用洗洁精洗净，模具上的残留的凝胶会影响胶的凝固过程，影响胶的均匀性；

②电极缓冲液用过不能再利用，因为水分蒸发离子浓度会变高，会影响蛋白质的活性，使电泳速度下降，条带不清晰；

③做PAGE时，加过硫酸铵和TEMED加入后胶会很快凝固，胶要保证无气泡，水封。

拔梳时要缓慢、平稳保证凹槽竖直，加样量在15ul左右，防止外溢，以免孔与孔之见横向影响，造成污染。

3.3.2westernblotting的讨论

1、比较图3-2与图3-3，发现其高度不一致，这是由于在照相是没有将两者放在一起，在做完电泳后，经照相后就直接丢了，没有考虑到后期处理。

这也是实验的大忌。

2、在图3-3的SDS-PAGE凝胶电泳成像带上，A2处的条带没有图3-1上A2处的条带清晰，明显有拖带现象，说明样品中有可能沉淀，在加上样缓冲液煮、离心、取上清的过程中处理不到位

3、在图3-4中明显看到电泳带断裂，是在电泳带上切下有A2部分进转膜操作中，由于操作失误将膜切段。

在操作此步骤是应小心。

4、实验注意问题：

①将膜铺在滤