白藜芦醇对肝癌BelWord下载.docx

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结果白藜芦醇浓度25μmol/L可抑制肝癌细胞Bel7404增殖,并诱导凋亡（P0.01）;

浓度100μmol/L正常肝细胞L02的增殖也受到抑制,并产生凋亡（P0.01）。

25,50μmol/L的白藜芦醇可抑制Bel7404细胞黏附细胞外基质纤连蛋白（FN）及降解基质的能力（P0.01）,对该细胞的运动能力无明显抑制作用。

结论一定浓度的白藜芦醇可抑制肝癌Bel7404细胞增殖，诱导其凋亡,并可能通过抑制Bel7404细胞与细胞外基质FN的黏附及对基质的降解来抑制Bel7404细胞的侵袭能力;

在较高浓度下（≥100μmol/L）,白藜芦醇对正常肝细胞株也产生抑制增殖和诱导凋亡的毒性作用。

【关键词】藜芦生物碱类癌肝细胞肝肿瘤细胞增殖细胞凋亡肿瘤侵润

自从葡萄酒中发现白藜芦醇以来,人们陆续发现它具有保护心肌细胞、改善微循环、抑制血小板聚集、抗内毒素休克、降血脂、抗脂质过氧化、镇咳、平喘、抗病原微生物及抗老年痴呆等众多生理功能。

近年来又发现白藜芦醇具有抗肿瘤功能,表现为对某些肿瘤的起始、促进、进展3个阶段均有抑制作用[1]。

白藜芦醇并非对所有肿瘤都有抑制作用,而且其抗肿瘤机制目前尚不明确。

肝癌为我国最常见的恶性肿瘤之一,是重要的抗肿瘤研究对象。

笔者从肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭方面探讨白藜芦醇的抗肝癌细胞株机制,以及对正常肝细胞的毒性作用。

1材料与方法

1.1材料肝癌细胞Bel7404及正常肝细胞L02均由福建省肝胆外科研究所提供;

白藜芦醇由福建师范大学生物工程学院提纯生产（纯度约99.8%）;

RPMI1640和DMEM培养基（美国Gibco公司）;

噻唑蓝（thiazolylblue,MTT）、胰蛋白酶（北京华美生物科技有限公司）;

PCNA试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）;

TUNEL试剂盒（美国Premega公司）;

Transwell小室（美国Corning公司）;

纤连蛋白（FN）和基底膜基质凝胶Matrigel（美国BD公司）。

1.2细胞培养肝癌细胞Bel7404在含10%小牛血清的RPMI1640中、L02在含10%小牛血清的DMEM中培养,当细胞生长达到80%融和时,取处于对数生长期的细胞用于实验。

实验均分为2组;

对照组不加白藜芦醇,处理组中加入不同浓度的白藜芦醇。

1.3细胞增殖测定

（1）用0.25%胰蛋白酶将细胞消化制成2×

105mL1单细胞悬液,按每孔100μL接种于96孔板,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50,100,200μmol/L,分别在12,24,48h各取1块板,换不含血清的培养液每孔100μL,各孔中加MTT10μL（5mg/mL）,孵育4h,加入MTT裂解液（10%SDS,5%异丁醇,0.012mmol/LHCL）100μL,37℃孵育18h后,酶标仪（BioRad550型,美国BioRad公司）测取D（550nm）的光密度值,取4孔平均值。

该值反映活细胞数目,即细胞增殖程度。

（2）制备2×

105mL1单细胞悬液,接种于置于6孔板中的玻片上,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50,100,200μmol/L。

选择48h作为终止时间,按试剂盒说明书进行。

以已知PCNA阳性的乳腺癌细胞作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。

显微镜下观察,计算PCNA标记指数,即计数1000个肿瘤细胞中PCNA阳性细胞的百分率。

1.4细胞凋亡测定

（1）细胞经过同步化后,即无血清培养24h,再加入10%血清及不同浓度白藜芦醇（12.5,25,50,100,200μmol/L）培养48h。

收集悬浮细胞及贴壁细胞,经2000r/min离心5min,沉淀重悬于PBS1mL,400目筛网过滤,取细胞悬（COULTEREPICSXL型,美国BeckmanCoulter公司）488nm激发,605nm检测,每次检测104个细胞。

用MultyCycle软件进行DNA含量和细胞凋亡率分析,DNA含量低于G1期二倍体DNA的细胞为亚二倍体细胞。

（2）按PCNA检测方法接种细胞,选择3个浓度白藜芦醇（25,50,100μmol/L）作用细胞48h。

按TUNEL试剂盒说明书进行,以DNaseⅠ处理肿瘤细胞作为阳性对照。

显微镜下随机计数200个细胞,计算阳性细胞比率。

1.5细胞侵袭检测

1.5.1细胞黏附试验（MTT法）取96孔培养板,每孔加入FN20μL（100mg/L）,风干后置4℃备用,用PBS洗2次重新水化。

2×

105mL1浓度的Bel7404细胞悬液加入96孔细胞培养板上,每孔100μL,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50μmol/L,每组复3孔。

置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内,分别于30,60,90min后,弃去上清液,PBS冲洗2次除去未黏附细胞。

黏附细胞用MTT法在酶标仪上测定D（550nm）值,并计算黏附抑制率:

黏附抑制率＝（对照组黏附细胞D值处理组黏附细胞D值）/对照组黏附细胞D值

1.5.2细胞运动实验在Transwell小室滤膜的下室面铺上FN10μL（0.2mg/mL）,超净工作台中风干备用。

取1×

106mL-1Bel7404细胞悬液（培养基为0.1%BSA的RPMI1640）,处理组Transwell小室的上室中加入白藜芦醇（终浓度分别为12.5,25,50μmol/L的细胞悬液100μL）,下室分别加入用上述培养基制成白藜芦醇溶液600μL,终浓度与上室相同,各组均复3孔。

37℃、体积分数为0.05的CO2中培养12h后取出滤膜,甲醇固定,棉签拭去上室面的细胞,常规苏木精伊红（HE）染色。

随机于显微镜下取上、下、左、右、中心5个视

野,计数穿膜细胞数。

以该细胞数目表示肿瘤细胞的运动能力。

1.5.3体外侵袭实验使用运动实验中的Transwell小室,滤膜的下室面铺上FN并风干后,在小室上室面均匀铺上1∶3RPMI1640稀释的Matrigel,置37℃培养箱30min使之凝固,其他步骤同1.5.2，以计数穿膜细胞数目来反映肿瘤细胞降解Matrigel的能力。

1.6统计学处理数据采用SPSS11.5统计软件包进行分析,各组间比较采用双侧t检验。

2结果

2.1对细胞增殖的影响

2.1.1MTT法作用48h后,25μmol/L白藜芦醇可抑制Bel7404细胞增殖（P0.01）,且对Bel7404细胞的抑制程度随时间延长、剂量增加呈加大趋势,白藜芦醇达到较高浓度（100μmol/L和200μmol/L）时,正常肝细胞L02和Bel7404细胞的生长均受到抑制（P0.01,表1）。

2.1.2PCNA法计数结果与MTT法检测结果基本吻合（表2）。

白藜芦醇浓度25μmol/L时,可抑制Bel7404细胞的增殖（P0.01）;

浓度100μmol/L时,正常肝细胞L02亦受到抑制（P0.01,图1）。

2.2对细胞凋亡的影响

2.2.1流式细胞术50μmol/L白藜芦醇作用下,Bel7404细胞出现明显的亚二倍体峰（图2）,L02细胞则没有。

而100,200μmol/L处理组,2种细胞均出现了明显的亚二倍体峰。

2.2.2TUNEL法在50μmol/L白藜芦醇作用下,Bel7404细胞数目减少,出现凋亡细胞（P0.01）;

100μmol/L时,L02细胞也出现凋亡（P0.01,图3）,计数结果见表3。

表1白藜芦醇不同作用时间对Bel7404细胞和L02细胞增殖的影响表中数据为MTT法检测的不同时间段增殖细胞的D（550nm）值.与对照组比较,☆:

P0.05，☆☆:

P0.01.表中数据为计数1000个Bel7404细胞中PCNA阳性细胞的百分率（%）.与对照组比较,☆:

P0.05，☆☆:

P0.01.

2.3对肝癌Bel7404细胞侵袭的影响黏附试验:

随作用时间的延长,25,50μmol/L的白藜芦醇表3TUNEL法检测白藜芦醇对L02及Bel7404细胞凋亡的影响表中数据为TUNEL法检测的阳性细胞百分比（%）.与对照组比较,☆☆:

对Bel7404细胞的黏附细胞外基质FN能力均有明显的抑制（P0.05,表4）,且抑制程度随浓度增大而递增;

12.5μmol/L无明显抑制作用（P0.05）。

运动试验:

各种浓度的白藜芦醇处理12h对Bel7404细胞的运动能力均无明显的抑制作用（表5）。

侵袭试验:

25,50μmol/L白藜芦醇对Bel7404细胞的降解细胞外基质的能力均有明显的抑制（P0.05,表5）,12.5μmol/L的白藜芦醇无明显抑制作用（P0.05）。

3讨论

白藜芦醇是一种来源于虎杖、葡萄等常见植物、具有众多生理药理功能的天然药物。

近年来的研究表明,白藜芦醇通过多种途径对多种肿瘤细胞（包括肝癌）有显著抑制作用[2]。

本研究显示,一定浓度的白藜芦醇可抑制肝癌Bel7404细胞增殖、诱导细胞凋亡,从而显著抑制Bel7404细胞的生长。

有报道称,白藜芦醇可明显抑制HL60白血病细胞生长,而不影响正常外周血液淋巴细胞[3]。

小鼠口服较高剂量的白藜芦醇,4周后检测各项血液生化指标,表4白藜芦醇对Bel7404细胞黏附纤连蛋白能力的影响表中数据为MTT法检测的不同时间段黏附细胞的D（550nm）值.与对照组比较,☆:

P0.05,☆☆:

P0.01.表5白藜芦醇对Bel7404运动能力及侵袭能力的影响表中数据为运动实验及侵袭实验中穿膜细胞数目.与对照组比较,☆☆:

P0.01

均未发现异常改变[4]。

国内研究显示,白藜芦醇能诱导胆囊癌GBC细胞凋亡而抑制其生长与增殖,但对正常成纤维细胞3T3细胞无此作用[5]，提示白藜芦醇可能对肿瘤细胞有选择性抑制作用,而对正常细胞无影响。

本实验发现,当白藜芦醇浓度较高时,不仅对肝癌细胞有显著的抑制增殖和诱导凋亡作用,对正常肝细胞也产生类似的作用,特别在200μmol/L白藜芦醇的作用下,肺癌细胞株和正常肝细胞株均受到显著抑制,生长极为缓慢,显微镜下可见大量漂浮细胞和凋亡细胞。

当浓度较低时,白藜芦醇对正常细胞无影响,对肝癌细胞仍有抑制生长作用。

因此可认为,在一定浓度范围内,白藜芦醇是一种低毒的肝癌细胞抑制药物;

而超过这个浓度后,它对正常细胞也表现为抑制增殖、诱导凋亡的毒性作用,并非如前述国内外研究所认为的对正常细胞没有影响[3,6]。

肿瘤的侵袭和转移极为复杂,从分子水平可大致分成3个过程:

肿瘤细胞通过受体结合与胞外基质中的FN和层黏连蛋白（LN）相黏附;

肿瘤细胞沿着趋化剂的浓度梯度迁移;

肿瘤细胞释放各种水解酶类,溶解、破坏其黏附部位的组织,使肿瘤细胞得以通过缺损游出而向远处转移[5]。

通过设置前述的黏附、运动、侵袭3项实验,可以在体外模拟这几个过程,观察肿瘤细胞的侵袭能力。

本研究发现,浓度较高的白藜芦醇（100μmol/L）作用于肝癌细胞时,12h即可抑制细胞生长,而50μmol/L白藜芦醇至少需作用24h才具有抑制瘤细胞增殖的作用,笔者在对白藜芦醇抑制肝癌细胞侵袭的研究中采用12.5,25,50μmol/L3种较低浓度的白藜芦醇,作用肝癌细胞12h,旨在反映白藜芦醇在不抑制细胞增殖的低浓度情况下是否具有抗侵袭作用。

结果表明,白藜芦醇能显著抑制肝癌细胞与细胞外基质FN的黏附及对细胞外基质降解的能力,而对肝癌细胞的运动能力无明显抑制作用，提示白藜芦醇可能通过抑制肿瘤细胞与细胞外基质FN的黏附及降解基质能力两个环节发挥其抗肿瘤侵袭的作用。

有文献报道,白藜芦醇可通过抑制MMP9mRNA的表达抑制MMP9的活性,而MMP9正是一种具有降解基底膜基质功能的酶,与肿瘤的侵袭密切相关[7]。

本研究中白藜芦醇所显示的抑制肝癌细胞降解基质的作用是否与MMP9有关，尚待进一步探讨。

【参考文献】

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