基因工程知识点全docWord格式.docx
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5.什么是穿梭载体
人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。
6.入-噬菌体载体及构建
-DNA为线状双链DNA分子，长度为，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。
1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点
引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性灭活某些与裂解周期有关基因。
使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现象的发生。
加装选择标记，便于重组体的检测
单链噬菌体DNA载体
过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。
引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列
（lacZ’）的乳糖操纵子片段（lac）、组氨酸操纵子片段（his）以及抗生素抗性基因等。
将人工合成的多克隆位点接头片段插在lacZ’标记基因内部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色。
（4）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物序列，使得重组DNA分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。
8.II类限制性内切核酸酶的特点
限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）是一类能在特异位点上催化双链
DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶。
识别位点的特异性：
每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5或6核苷酸
组成的特定序列（靶序列）。
识别序列的对称性：
靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈
回文结构。
切割位点的规范性：
双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可
形成粘性末端或平末端的DNA分子）。
同位酶：
一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶。
同裂酶：
识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶
同尾酶（Isocandamers）：
识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。
9.甲基化酶
Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识
别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。
甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一种酶的切口
甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使DNA免受相应的限制性核酸内
切酶的切割。
甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。
连接酶连接作用的特点:
①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基（-OH），另一条DNA链的5’末
端有一个磷酸基（-P）的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接DNA分子的作用。
②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。
③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick），而不
能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。
⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连
接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD＋或ATP）
11.大肠杆菌DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用
DNA聚合酶作用的特点：
要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA。
接受模板指导。
需要有引物（3’羟基）的存在。
不能起始合成新的DNA链。
催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端。
催化DNA的合成方向是5’→3’。
Klenow酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶。
分子量为76kDa。
Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。
Klenow酶的基本用途：
修复由限制性核酸内切酶造成的3’凹端，使
之成为平头末端。
以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA
片段进行标记。
用于催化cDNA第二链的合成。
用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。
聚合酶
T4-DNA聚合酶酶的基本特性：
有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性。
在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切。
在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。
在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
T4-DNA聚合酶的基本用途：
切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端
13.影响连接效率的因素有：
温度（最主要的因素）离子浓度
ATP的浓度（10M-1M）
连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）
反应时间（通常连接过夜）
插入片段和载体片段的摩尔比
DNA末端性质
DNA片段的大小
14.如何将不同DNA分子末端进行连接
1.相同粘性末端的连接
如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶
联合酶解，两种DNA分子均含有相同的粘性末端，因此混合后能顺利的连接成一个重组
分子
DNA
2.平头末端的连接
T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下，能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。
3.不用粘性末端的连接
3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平
5’端的粘性末端用klenow酶补平，或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接
15.碱性磷酸酶有什么作用
1.该酶用于载体DNA的5’末端除磷操作，以提高重组效率；
2.用于外源DNA片段的5’端除磷，则可有效防止外源DNA片段之间的连接。
16.末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用
给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾。
DNA片段3’末端的同位素标记。
17.2、细菌转化的步骤：
感受态的形成。
感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。
感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与
细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，
使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等。
转化因子的结合。
受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特
异性结合，单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。
转化因子的吸收。
双链DNA分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中。
整合复合物前体的形成。
进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，
形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，
并将其引导至受体菌染色体DNA处。
转化因子单链DNA的整合。
供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA
的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。
+诱导转化原理：
①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生
剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。
但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。
介导细菌的原生质体转化
PEG是乙二醇的多聚物,存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构,
使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两
细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合。
20.电穿孔法
是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA直接通
过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。
P52接合转化，入噬菌体感染未归纳
21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面
载体本身的性质：
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。
载体的空间构象：
与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体。
插入片段大小：
对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。
重组DNA分子的浓度和纯度
受体细胞方面：
受体细胞必须与载体相匹配
转化操作的影响
22.转化细胞的扩增
转化细胞的扩增操作：
指转化完成之后细胞的短时间培养。
在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：
Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时
原生质体转化后的再生过程
λ噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。
扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。
表达外源基因，便于筛选和鉴定。
23.抗药性筛选法
这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。
抗药性筛选法的基本原理：
抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外
源DNA片段插在EcoRI位点：
非重组子呈
Apr
、Tcr
重组子呈
将外源DNA片段插在
BamHI位点：
重组子呈Apr、Tcs
抗药性筛选法的基本操作：
先将转化液涂布含有Ap的平板
再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上
在Ap平板上生长，但在Tc平板上不长的转化子即为重组子P56
抗药性标记插入失活选择法
经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子，也含有不需要的非重组子。
为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。
如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活，这种抗药性标记就会消失，从而筛选出阳性重组子。
24.什么是蓝白斑筛选法
这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。
主要是在载体的非必要区插入一个带
有大肠杆菌—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷（X-gal）平板上形成浅蓝色的噬菌斑。
外源基因插人lac（或lac基因部分被取代）后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷（X-gal）平板上形成白lac-
色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。
筛选法
利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR
产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。
由于在载体DNA分子中，外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的，可以设计合成相应的
PCR引物，以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应，反应产物经琼脂糖凝胶
电泳，若出现特异性扩增DNA带，并且其分子量同预期的一致，则可确定含此重组DNA分子
的重组子是期待的重组子。
第三章基因工程的常规技术
1.探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：
同源或部分同源探针
cDNA探针
人工合成的寡核苷酸探针
标记方法：
①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法
4.什么是ABC荧光（显色酶）标记法ABC标记法。
A为Avidin（生物素抗性蛋白），每个Avidin分子可结合3-4个生物素分子；
B为Biotin（生物素），每个Biotin分子可结合2个C为Complex，首先将Biotin共价结合在探针分子上，
Avidin分子；
荧光胺标记在
Avidin
上，两
者形成复合物，即可将荧光胺标记在探针上，发出的荧光也能使普通胶片感光。
如
果将某一生色酶接在Avidin上，并辅以合适底物，则杂交反应还可直接以颜色反应检测，这一技术称为酶标技术
5.亚克隆法
亚克隆：
是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆。
一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后，将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞，然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定，获得含有目的基因
的重组子。
此时，该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除。
6.菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程
该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上
暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交
经溶菌和变性处理后使
筛选出含有插入序列菌落。
操作步骤：
①菌落生长
②转移到NC膜上
③DNA释放和变性
（变成单链DNA）：
10％SDSNaOH④中和Tris-HClpH
⑤固定80℃120’⑥杂交（包括预杂交，加探针DNA杂交）
⑦放射自显影
⑧对照比较，选出重组克隆
7.鸟枪法
鸟枪法：
将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNA片段，分别连
接到载体DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含有目的基因的
期望重组子。
鸟枪法制备目的基因的主要步骤
①目的基因组DNA片段的制备
超声波处理：
片段长度均一，大小可控，平头末端。
（原核生物的基因长度大都在2Kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达
100Kb以上）。
全酶切：
片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。
部分酶切：
片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。
②DNA片段与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；
如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。
③重组DNA分子导入受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细
胞；
如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。
④筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。
⑤目的基因的定位
利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的DNA片段，必须通过次级克隆或插入灭活，在已克隆的DNA片段上准确定位目的基因，然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列。
法
酶促逆转录主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离的目的基因。
这种方法以目
的基因的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA，即cDNA，然后在DNA聚合酶
的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载体重组后转入受体菌扩增，获得目的基因的cDNA
克隆。
的分离纯化
绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴，利用它可以迅速的
将mRNA从细胞总的混合物中分离出来，将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上，制
成亲和层析柱，然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离，mRNA会挂在层析住上，后洗脱
即可分离
10.简述PCR技术的基本原理，PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的
PCR技术的基本原理：
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡
核苷酸引物。
过程：
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR
扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，
引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，
靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留
复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链
又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因
扩增放大几百万倍。
11.什么是基因组文库其构建方法是怎样的
是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要
时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库
又称DNA文库。
基因组文库构建的一般步骤
①载体的选择和制备。
②高纯度、大分子量基因组DNA的提取。
③基因组DNA的部分酶切与分级分离。
④载体与DNA片段的连接。
⑤转化或侵染宿主细胞。
⑥筛选鉴定基因组及保存。
12.基因组DNA文库的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组DNA
文库应具备下列条件：
重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力
载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分
隔克隆。
克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以
利于克隆排序。
克隆片段易于从载体分子上完整卸下。
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。
基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法
13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列
片段大小要均一
文库构建的步骤
细胞总RNA的提取和mRNA的分离
第一链cDNA合成
第二链cDNA合成
双链cDNA的分级分离
双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖
重组体的筛选与鉴定
第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达
1.启动子
启动子：
是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并
能起始转录的序列，其大小在20～300个碱基，
是控制基因转录的重要调控元件。
在一定条件下
mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关，而
转录又在很大程度上影响基因的表达。
启动子的特征：
①序列特异性②方向性③位置特
性④种属特异性
2.启动子类型
组成型启动子：
是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。
组织特异启动子：
又称器官特异性启动子。
在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。
诱导型启动子：
是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。
目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。
3.终止子
终止子：
是位于结构基因下游的一段
DNA序列，基因转录时，该序列被转录为
mRNA的一部
分，并形成特殊的二级结构，由此终止基因的转录。
序列
SD序列：
mRNA中起始密码子上游
8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，
它可以与
30S亚基中的16SrRNA3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于
mRNA的翻译从
起始密码子处开始
5.密码子
不同生物对密码子的偏爱性
1.生物体基因组中的碱基含量
2.密码子与反密码子的相互作用的自由能
3.细胞内tRNA的含量
6.密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。
一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：
外源基因全合成
同步表达相关tRNA编码基因
7.包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体
8.包涵体的
升级会员 