医院微生物标准化操作规程人民医院检验科 细菌SOP人民医院检验科管理文件人民医院质量管理体系文件Word格式文档下载.docx
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现代临床医学的发展，广谱、超广谱抗生素的广泛使用，使耐药株增加，院内感染率上升，血液培养中分离出各种微生物种类显著增多，以前认为致病、条件致病或非致病菌的界限现在已不再如此绝对区分。
因为任何一种机会致病菌均可能成为败血症的病原菌。
其鉴别可依据：
1，培养结果2次以上为同一细菌者；
2，患者于检出细菌2—3周后，血液中相应抗体滴度上升，均可视为败血症的病原菌。
4.2下呼吸道标本送检指征
4.2.1症状指征：
咳嗽、咯血、呼吸困难、发热。
4.2.2疾病指征：
白喉、百日咳、猩红热、肺炎、肺结核、肺脓肿。
4.2.3标本采集时间：
以清晨留取标本为好。
留取前最好用清水漱口三次.痰由患者用力咳出.纤维支气管镜检查者可同时抽取分泌物.昏迷患者可作气管穿刺吸取.所有标本最好在应用抗菌药物之前采集标本。
4.2.4采集方法
自然咳痰法、支气管镜采集法、胃内采痰法、气管穿刺法、小儿取痰法
4.2.5上呼吸道标本采集上呼吸道标本通常采用无菌棉拭子。
采集前患者应用清水反复漱口，由检查者将舌头向外拉，使腭垂尽可能向外牵引，将棉拭子通过舌根到咽后壁或腭垂的后侧，涂抹数次，但拭子药避免接触口腔和舌粘膜。
4.2.6检验方法直接涂片法
4.2.6.1痰标本
挑取阳性（脓性或血）部分制备2张涂片，一张做革兰染色，另一张根据需要做其他染色。
革兰染色后用低倍镜观察白细胞和上皮细胞数量的多少来初步判定。
如白细胞<
10，上皮细胞<
25，则要求重新留取标本，不宜做培养；
白细胞>
25时，还要参照高倍镜下的情况进行区分：
①视野中有少量扁平上皮细胞（或无），少量白细胞，见3种以上细菌，说明为唾液，不宜培养。
②视野中见有数量不等的白细胞或纤毛拄状上皮细胞或二者同在，有一种细菌或两种（少见，见于免疫功能低下者），将结果记录下来，同时报告临床医师。
③标本被证实来自下呼吸道后，用油镜观察细菌的着色、形态及排列，大致可以通过涂片镜检做出初步病原学诊断，如葡萄球菌、肺炎链球菌、假丝酵母菌。
4.2.6.2上呼吸道标本涂片
将分泌物直接涂于两张清洁玻片上，一张做革兰染色，另一张根据情况做特殊染色。
白喉棒状杆菌：
查见革兰阳性棒状杆菌，排列不规则，用异染颗粒染色有明显异染颗粒，则可作出初步报告。
4.3尿
4.3.1送检指征
4.3.1.1症状指征:
尿频、尿急、尿痛等膀胱刺激症状、血尿、尿道口脓性分泌物、发热。
4.3.1.2疾病指征:
泌尿系统感染、肾结核、泌尿结石、前列腺增生、无症状性菌尿。
4.3.2标本采集时间：
一般用中段尿采集方法采集。
通常应清晨起床第一次尿液送检。
必要时可导尿留取标本.（不应该从留置导尿管中抽取尿标本）,必要时也可作耻骨联合上膀胱穿刺抽取尿液标本.原则上应选择在抗菌药物应用之前采集尿液。
4.3.3采集方法
中段尿采集方法、肾盂尿采集方法、膀胱穿刺采集方法、导尿法
4.3.4培养检查
4.3.4.1普通培养，用无菌接种环取尿液分别接种于血平板麦康凯35度培养18-24小时观察结果选择相应方法进一步鉴定。
48小时无细菌生长报告无菌生长。
4.3.4.2定量培养1倾注平板法用无菌生理盐水9.9ML尿液0.1ML充分混匀，取1ML放入平皿中，同时加入已融化并冷却至50度的培养液与尿混合，待凝固后置35度24小时。
生长菌落数乘以100既相当于每ML中菌落数2）平板接种法，取尿5UL滴注于平版上抹匀35度24小时记数生长的菌落数乘以200既为每ML菌数3）定量接种环涂抹法用定量接种环（10UL）蘸取尿液。
在平板上均匀划线接种35度24小时计数生长的菌落数乘以100，求出每ML的菌数。
做定量培养，菌落数过多时不可计数时则报告》10.5CFU/ML。
4.3.5临床意义
尿液细菌学检验可以反映肾脏,膀胱,尿道,前列腺等处的炎症变化.尿液的细菌学检验除有诊断价值以外,还可以帮助临床医师选择有效抗菌药物,以减少因用药不当而造成的耐药菌株的增加.诊断泌尿系感染的细菌学标准是:
菌落计数>
10CFU/ML
4.4粪便送检指征
4.4.1症状指征：
腹泻、高热惊厥。
4.4.2疾病指征：
侵袭性病原引起的腹泻1）细菌性痢疾2）肠炎3）肠结核。
肠毒素性病原引起的腹泻、抗菌药物相关性腹泻。
4.4.3标本采集：
腹泻病人应在急性期采集，以提高检出率，亦最好在用药之前。
沙门氏菌感染肠热症在2周以后，胃肠炎病人在急性期，早期采集新鲜粪便,应采集粪便异常部分。
最好在抗菌药物应用以前留取。
4.4.4采集方法
自然排便采集法、直肠拭子方法
4.4.5检验方法
4.4.5.1直接涂片检查
霍乱弧菌涂片检查
染色法，涂片用甲醇或乙醇固定革兰氏染色镜检观察革兰氏阴性，呈鱼群样排列杆状或弧形菌。
悬滴（压滴）检查，检查细菌动力，霍乱弧菌古典生物型和ＥＬＴＯＲ生物型均呈川梭状运动在悬滴涂片中加入Ｏ１群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察。
若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
可初步报告为疑似Ｏ１群霍乱弧菌。
并申报上级卫生机构做出处理。
4.4.5.2培养检查
将大便接种于中国兰或麦康凯及SS培养基经35CO，18-24小时，挑取可疑不发酵乳糖菌落接种三糖铁和尿素动力定基质根据其生化反应结果选择适宜的血清学分型
霍乱弧菌。
1克大便直接接种于硷性蛋白胨水中于35CO6-8小时转种4号琼脂平板挑取生长菌落进行进一步监定。
4.4.6临床意义
肠道病原菌能引起人类感染性腹泻，亦能由细菌的代谢产物而造成食物中毒，亦能由于长期应用抗菌药物而导致菌群紊乱所致严重腹泻，因此，应及早做出诊断以免延误治疗。
4.5化脓和创伤标本送检指征
4.5.1症状指征：
局部症状如红、肿、热、痛和功能障碍时化脓性感染的五个典型症状。
全身症状轻重不一，感染轻微的可无全身症状，感染重的常有发热、头痛、全身不适、乏力、食欲减退等。
4.5.2疾病指征：
软组织的急性化脓性炎症、化脓性疾病、脓肿、创伤感染。
4.5.3标本采集：
开放性感染和已溃破的化脓灶：
标本采集前先用灭菌生理盐水冲洗表面污染，用灭菌拭子采取脓液及病灶深部的分泌物。
封闭性脓肿通常采用引流术采集。
如为慢性感染可抽取感染坏死组织于健康组织之间的少许组织作为培养标本.
4.5.4检验方法：
4.5.4.1直接涂片检查：
取洁净玻片将标本均匀涂成薄膜，自然干燥，经火焰固定革兰染色镜检，根据细菌的染色特点、形态、排列作出初步报告“找到革兰阴性或阳性球或杆菌呈**排列”。
如发现具有芽孢或荚膜的细菌，报告时应注明芽孢的大小位置：
如镜检发现细菌可初步报告“未找到细菌”；
对疑有分枝杆菌感染时，标本应作抗酸染色；
疑是白喉感染时，标本除作革兰染色，还应作异染颗粒染色。
4.5.4.2细菌培养：
取脓汁棉拭子或脓汁接种于血平板上划线分离，置370C培养18-24小时，观察结果，如有菌落生长，根据涂片染色特点和菌落特征初步判断细菌的类属，然后再按其生物学特性进行鉴定。
4.5.5临床意义：
所有创伤均可有细菌污染，但不一定发生感染，细菌学检查对局部细菌的控制是有价值的。
同时对导致伤口感染、脓肿形成的病原学诊断有重要意义。
确定常居菌是否为创伤感染的病原菌时，要注意该菌是否在数量上占优势。
目前看细菌向活组织深部侵入程度及细菌每克组织含细菌量是否达到一定阈值。
一般认为每克组织内细菌数量在105-106个以上时，即可造成伤口感染。
4.6穿刺液送检指征
4.6.1脑脊液
4.6.1.1症状指征：
在成人一般表现为发热、头痛、恶心、呕吐、颈强直和反射增强，婴儿和新生儿临床表现经常不明确和无特异性，对婴儿不明原因的发热，应怀疑为脑膜炎，应采集脑脊液即使送检。
4.6.1.2疾病指征：
细菌性脑膜炎拭一组病情较严重的急性感染性疾病。
本病可由多种致病菌引起。
4.6.2胸腹水送检指征
4.6.2.1症状指征：
临床症状多伴由胸痛和发热，腹部出现局限性腹胀及揉面感，胸腔积液有混浊、乳糜性、血性或脓性，腹水成人多于肝硬化腹水者。
4.6.2.2疾病指征：
结核性胸膜炎、细菌性肺炎引起的胸膜炎、真菌、原发性腹膜炎、续发性急性腹膜炎。
4.6.2.3采集：
怀疑为脑膜炎的病人，应立即采集脑脊液，最好在使用药物之前采集标本。
胸腹水怀疑感染存在，应尽早采集标本，一般在患者使用抗菌药物之前或停用后1-2天采集。
4.7生殖道标本送检指征
4.7.1症状指征：
全身症状：
发热、乏力、食欲不振。
皮肤黏膜损害。
男性泌尿生殖道系统表现：
尿痛、尿频、尿急、尿道分泌物增多、性功能障碍等。
性生殖系统表现：
阴道分泌物增多及性状异常、月经失调、阴道出血等。
4.7.2疾病指征：
前庭大腺脓肿、外阴阴道念珠菌病、细菌性阴道病、急性子宫颈炎、急性盆腔
炎、急性尿道炎、急性膀胱炎、羊膜腔感染、产褥气感染。
4.7.3标本采集：
清洗尿道口，用灭菌纱布或棉球擦拭，采取脓形分泌物。
4.8烧伤标本送检指征
4.8.1症状指征：
烧伤伴有细菌感染或出现败血症等。
4.8.2疾病指征：
烧伤创面脓毒症。
烧伤病发症：
如肺部感染、静脉炎、烧伤败血症、肠原性感染等。
4.8.3采集：
烧伤面愈合前，都可能发生侵袭性感染，通常在早期、深度烧伤溶痂和3度焦痂分离期、后期采集标本。
用无菌棉拭子，直接从烧伤创面的脓汁多部位采集，发生败血症应同时做血培养。
5.注意事项
当某些标本的留取出现困难和问题时,请临床科室和实验室密切配合,及时处理。
为确保病原微生物的检出率,应尽量减少中间环节.采集好的标本应立即送检,争取在10-20分钟内送到实验室,否则有些微生物会死亡而影响检出。
6.参考文献
张秀珍主编《当代细菌检验与临床》人民卫生出版社
微生物标本接收处理
接种前标本接收处理：
1:
核对接到标本后,检查化验单填写和标本是否一致,和标本是否合格.若标本不合格,退回临床并及时通知临床,然后记录退回标本的病人姓名,科室以及原因.（具体见2）
2：
标本拒收出现以下情况，工作人员可根据具体判断拒收标本。
2.1申请单无检查项目或检查项目不清楚的标本，非本实验室检测项目的标本。
2.2姓名明显变更，或出现多个姓名，无法确认标本正确归属的。
2.3申请单和标本分离，标本容器上又无明确患者信息标识的。
2.4空管、标本量过少（标本量见《临床微生物标本采集程序》）的标本。
2.5收集容器不正确；
使用非无菌管留取培养标本，用普通大便盒留取培养标本等。
正确收集容器见《临床微生物标本采集程序》。
2.6检标本类别不符，如申请单注明血，但送检标本为胸水。
2.7标本外部有严重的遗洒、渗漏，怀疑标本可能交叉污染的，化验单严重污染，无法填写报告的。
2.8经询问确认标本保存、运输方式不正确的，具体保存方式见《临床微生物标本采集程序》。
2.9审核报告时发现标本超过有效检测时间或污染的，也应视为不合格标本，按拒收标本处理，不能发出报告。
3:
拒收处理
3.1对不合格标本应在化验单上注明拒收原因及处理建议,及时发回。
3.2如为门诊或急诊患者标本，应由服务台人员或值班人员尽快告知送标本者。
3.3如为病房急诊或常规标本，当时发现的应及时退给护理员；
经核查后发现的应在2h内给病房打电话，并填写《不合格标本电话通知记录表》，且于当日将标注清楚的化验单发回病房；
对于无法及时报告的不合格门诊标本，应当天将标注清楚的化验单反给病案室或化验单查询处。
3.4将不合格化验单中患者信息和拒收原因填写《不合格标本电话通知记录表》，以备查询。
3.5对于审核报告时发现与临床严重不符或临床根本不可能出现的结果，而怀疑标本超过有效检测时间或污染的情况，应及时与临床电话联系，并填写《不合格标本电话通知记录表》。
3.6对于同一病人多次因相同原因拒收标本的，应及时与主管医生联系，了解原因提出建议。
4：
标本接种合格标本写上接收日期和时间,并登记,记帐.然后接种.
4.1接种的方法以及分类.
⑴点燃酒精灯,右手持接种工具,在火焰上烧灼灭菌.
⑵左手持标本管或原代培养物的平皿,试管等.
⑶用接种工具挑取适量标本或细菌,痰液挑取脓块,避开口水;
痢疾粪便挑取脓血部分.原代培养物挑取单个菌落,液体中取菌,只需在培养液蘸取一满环即可.
⑷按培养目的分区划线或区域涂布的方法接种.接种到液体中时,将挑出的菌落在试管有液体的管壁中研磨,细菌即可转入液体中.做穿刺接种时,可垂直刺入高层琼脂中,并沿原位退出,注意不要穿刺到管底.
⑸接种后,把接种工具于火焰上烧灼后,放回原处.
4.1.1血培养：
以无菌手法真空采血，采血量为5—10ml，放35℃孵育5天后连续划线盲种一次。
4.1.2脑脊液：
连续划线接种于血平板及巧克力平板放于CO210%环境18-48小时后取出生长细菌染色。
根据革兰氏染色的形态进行细菌鉴定。
4.1.3痰及上呼吸道标本的检测：
接种于巧克力平板、血平板、麦康凯培养基,并四区画线分别放入35℃孵箱18-24小时后观察菌落特征。
4.1.4尿标本的检测：
连续划线接种于血平板及麦康凯培养基，放３５℃孵育１８－２４小时。
4.1.5分泌物、化脓性感染标本分区划线接种于血平板及麦康凯培养基，放３５℃孵箱１８－２４小时。
4.1.6胸腹水、穿刺液连续划线接种于血平板及麦康凯培养基，放３５℃孵箱１８－２４小时。
4.1.7大便标本：
腹泻、高热标本如怀疑霍乱弧菌用碱性蛋白胨水培养6-8小时,连续划线接种于4号琼脂孵育18-24小时。
常规用分区划线接种于麦康凯培养基35度生长18-24小时
5:
接种后标本处理
5.1标本接种后的微生物标本放入贴有生物危险2级的污物桶内,血培养标本接种后放置7天转种血平板,已转种的培养瓶放入贴有生物危险2级的污物桶内.贴有生物危险2级的污物桶用高压灭菌.
5.2抗酸杆菌标本放入用清洁的玻璃瓶留取后放入贴有生物危险2级的铁盒高压灭菌后涂片镜检.
5.3吸取菌液的滴管用后放入装有含氯2克/升的消毒液中冲洗后高压灭菌后使用
6：
工作总结及临床沟通：
6.1定期（一般一个季度）向临床科室报告从临床各种标本分离的细菌种类以及对抗菌药物的敏感性结果.供临床医生初步选择抗菌药物参考.
6.2分段报告微生物培养结果,以便临床医生及时用药.
6.2.1实验室工作人员接到标本后,按要求进行涂片和接种。
.不符合质量要求的标本,应及时与临床科室联系并重新留取标本.
6.2.2需要涂片的标本立即涂片染色，并尽快电话报告临床科室，正式报告于第二个工作日出具。
6.2.3在三个工作日内，对接种的标本进行鉴定并做抗菌药物敏感性试验,并出具书面报告。
特殊疑难菌种及时向临床电话报告，书面报告依鉴定程序顺延。
6.2.4需要保存的标准菌株和各种质控细菌按培养要求进行培养或保存。
6.2.5做好报告回访工作,了解实验室诊断结果和临床诊断的符合情况,从而找出存在的问题,以备改进工作。
7：
紧急情况的处理如遇到烈性传染性病原菌或严重院内感染和其他需要上报的菌种，需要立即与临床联系和上报保健科，并填写《医院紧急情况处理登记册》。
基本染色方法
1.染色准备：
染色的第一步是制作涂片。
菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。
菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
涂片时必须注意应轻轻操作。
猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。
制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
2.几种基本染色方法
2.1革兰染色
本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类。
2.1.1结晶紫溶液
A液：
结晶紫2g
95％乙醇20ml
B液：
草酸铵0.8g
蒸馏水80ml
需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
2.1.2碘液
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300ml
碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。
最后补足水量。
也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。
2.1.3脱色液：
95％乙醇。
2.1.4复染液
A.贮存液：
沙黄2.5g
95％乙醇100ml
B.应用液：
A液10ml
蒸馏水90ml
2.1.5染色方法：
A．涂片经火焰固定，加结晶紫液染30s，清水冲去染液。
B．加碘液染30s，水洗。
C．加脱色液，不时摇动约5～10s，至无紫色脱落为止，水洗。
D．加复染液，染30s，水洗。
E．干后镜检。
3、抗酸染色
抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。
染厚涂片时，须掌握复染色时间。
如果背景过深，影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；
有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。
抗酸染色有两种常用方法：
①碱性复红法又称萋纳（Ziehl—Neelsen）法（我们使用的方法）。
②荧光染料金胺O法（也称金胺O-罗丹明B法）。
碱性复红染色法
3.1试剂
3.1.1萋纳石炭酸复红溶液
碱性复红乙醇饱和溶液10ml
5％石炭酸溶液90ml
3.1.2脱色剂*
浓盐酸3ml
95％乙醇97ml
3.1.3复染液（吕弗勒美蓝液）
美蓝乙醇饱和溶液30ml
10％氢氧化钾0.1ml
蒸馏水100ml
3.2、染色方法
3.2.1涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。
染5min（若染色奴卡菌需要加长时间），水洗。
3.2.2加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。
3.2.3加复染液，染0.5～lmin，水洗。
3.2.4干后镜检。
分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。
3.2.5奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2％硫酸水溶液。
4、墨汁荚膜染色
用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。
传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。
常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。
有人用5％黑色素（nigrosin）水溶液做染料，效果较好。
4.1、试剂
印度墨汁或5％黑色素水溶液。
4.2、染色方法
将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。
在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。
找到后，转换高倍镜确认。
HF151UV二氧化碳孵箱操作程序及维护
某些细菌（如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、牛布鲁菌等）在5％――10％的CO2环境中生长较好，比在一般情况下生长速度较快，为了更及时准确地检测出致病菌，为临床提供治疗诊断的依据。
2.原理：
本仪器是通过人为地调节仪器内部的CO2达到一定浓度，造就一个适合上述细菌生长的厌氧环境，使细菌生长速度加快，缩短TAT。
3.工作条件：
环境温度：
18－30℃相对湿度：
<
80%
周围无强烈震动及腐蚀性气体存；
无阳光直接照射及其他冷热源的影响。
4.操作步骤：
4.1仪器出厂设置：
温度―――－37.0℃，％CO2――――.0％
4.2打开玻璃门，向水池中注入蒸馏水（约4L），关门。
4.3将超温控制器旋钮调至39℃。
4.4将仪器的通气接口连接于CO2气源。
4.5将仪器后壁开关调于OFF位置。
4.6将仪器接通电源，开机。
开机后仪器将自动执行常规检测功能，此时CO2及温度均显示【888】。
约40秒后，常规检测完毕，CO2及温度均显示腔内实际值。
4.7如果需要进行紫外清洁功能，需进行如下操作：
4.7.1在确保仪器内无培养物后，打开仪器后壁紫外清洁保护开关，将CO2设定为.0％。
4.7.2按【
】键不放，同时按住【▲】键或【
】键，使“℃”显示窗显示【222】，放开【
】,再连续按一下【
】，【％CO2】窗口显示【0】，此时，便进入了特殊功能“222”（紫外灯开关），按【
】＋【▲】，设定％CO2显示窗为【1】，并按【ī】键确认，紫外灯开关被打开，紫外灯点亮，【％CO2】窗口显示【---】，并闪烁。
4.7.3内腔中紫外灯点亮时，注意勿直视灯管！
4.7.4约30分钟后，清洁过程结束，内腔紫外灯熄灭，显示板显示实际值。
打开玻璃门，使腔内臭氧散出，关闭仪器后壁紫外灯保护开关。
（如果不需要进行清洁功能，只需按照第7步进行操作。
）
4.7.5同时按下【▲】键和【
】键约10秒钟，直至“％CO2”窗口显示【0.0】AUTO-START灯亮，放开两键。
仪器将启动AUTO-START功能。
4.7.6等待约16至24小时，此时仪器温度将显示37.0±
0.1℃，CO2将显示0±
0.1％CO2，一手按住【
】键，一手使用【▲】键或【
】键将温度显示窗内值置为3，放开两键，再按一下【
】键，然后按一下【ī】，此时CO2显示窗内
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