最全的动物疫病实验室检测方法Word格式文档下载.docx
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次）
............................................................35
新城疫病毒
检测试剂盒
.................................................................................................37
猪瘟病毒
......................................................................................................40
凝集、血凝实验操作方法
................................................................................................................43
弓形虫间接血凝试验（lHA）试剂使用说明书
..............................................................................43
伪狂犬病乳胶凝集试验试剂盒
....................................................................................................44
猪细小病毒病乳胶凝集试验〈LAT〉诊断试剂盒使用说明书
..................................................45
猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验〈LAT〉操作程序
.............................................................46
猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书及实验操作程序
........................................................47
口蹄疫正向间接血凝试验
............................................................................................................50
高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验程序
........................................................51
琼脂扩散试验
....................................................................................................................................53
鸡马立克氏病
................................................................................................................................53
禽流感琼脂凝胶免疫扩散试验
....................................................................................................55
荧光抗体检测
....................................................................................................................................57
猪瘟荧光抗体试验操作程序
........................................................................................................57
对狂犬病疑似动物脑组织的直接免疫荧光（dFA）检测
..............................................................58
血清学诊断检测常用试剂配方
........................................................................................................60
禽流感
HA
和
HI
试验用溶液的配制
..........................................................................................60
补充实验
............................................................................................................................................63
猪流感病毒
H1
亚型
Hl
试验抗原与阴、阳性血清说明书
........................................................63
1
检测
..............................................................................................................66
诊断试剂盒猪繁殖与呼吸综合症（Nsp2
1594~1680
变异株）RT-PCR
检测
实验
................................................................................................................................................68
一、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原与阴、阳性血清
................................................................71
二、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验
............................................................................................72
动物结核病诊断操作规程
............................................................................................................73
2
操作方法
检测试剂盒
一
试剂盒内含物
.说明书亚洲
型口蹄疫阳性对照血清（
己稀释浓度为
1:
8）
.96
孔
板亚洲
型口蹄疫阴性对照血清
.液体稀释槽3%
双氧水
.U
型96孔抗原抗体反应板25×
PBST洗涤液（稀释时准确量取）
.封板膜豚鼠抗血清稀释液
.灭活亚洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原
（用冰决包裹
）终止液
.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清包被缓冲液（碳酸盐）胶囊
.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物
（柠檬酸
-磷酸盐）缓冲液片剂
.兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物OPD
片剂
二
器材准备
（
需用户自备
）
1.移液器:
5-50µ
l移液器、0.2—10µ
l移液器、50—200µ
l移液器、50—300µ
l
12
道移液器各一把。
2.移液枪尖
（若干）。
3.抗原抗体反应板:
微量血凝板（U型、V型均可）5块,本试剂盒配备两块,用于被
检血清的稀释和抗原抗体反应。
注:
抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然
后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。
4.超纯水
无离子水或蒸馏水。
三、试剂准备（需用户完成）
1.包被缓冲液（PH9.6）
将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子
水中溶解即可。
4℃存放,1月内有效。
2.
洗涤液（PBST）
将本试剂盒配备的
25
倍浓缩
PBST
液（可能有结晶形成,用时微热溶化）用无离子
水或蒸馏水做1:
25稀释。
（如果PH降低,务必用NaOH调至7.4）
3.底物溶液
取1片柠檬酸—磷酸盐片剂（本试剂盒配备）溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL
溶液,
再加1片邻苯二胺（OPD）片剂,充分溶解,分装（5mL/
瓶或
10Ml∕瓶
）,
避光之-
2O℃保存。
用前避光溶化
临时每1mL上述溶液加
10µ
L
本试剂盒配备的
3%
的双氧
水（H202）
。
务必加双氧水!
四、操作步骤
1.用包被缓冲液稀释亚洲
型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1:
1000）,
在
板上每孔加
50µ
l,
振荡
封板或置湿盒内，室温过夜。
3
S1
8
S
4
5
6
7
9
+1:
32
-
16
1：
64
25
128
51
256
102
512
204
l02
409
S11:
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
-1:
S111:
S12
S13
S14
S15
S16
S17
S18
S19
S20
1024
2048
4096
抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应
根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。
图
96
孔酶标板检测
10
份样品布局图
为抗体滴度测定
（定量）
份样品布局图;
2
为抗体滴度测定（
定量
）检
测
20
份样品布局图。
以图
为例
在
U
型血凝板上按
50
µ
l/孔量用
将待检
血清从1:
4开始
做2倍连续稀释至
512。
同时,按图示稀释阴阳性对照血清
然后每孔加入
l
用
稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原
（1:
4,即1份病毒抗原、加3份
PBST）,
病毒抗原对照孔加100µ
l。
振荡混匀,封板,4℃过夜。
加入病毒抗原后血清的稀
释度变为从1:
8开始的2倍稀释。
3.用洗涤液
（1×
PBST）
洗
ELISA板5
次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从
抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50µ
l封板,37℃温育1小时。
4.同上洗板5次,
甩干。
用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清
至工作浓度
每孔加50µ
l,封板,37℃温育1小时。
5.同上洗板
5
次
l×
稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度
500）,
每孔加
封板
37
℃温育
小时。
6.
同上洗板5次,每孔加50µ
l底物溶液
（务必加双氧水）,37℃温育15分钟。
每孔再
加50µ
l终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值（OD492nm值）。
五
结果判定
1.
试验认可标准
每块板设
4
孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用
浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50µ
l/孔,病毒抗原对照OD492nm
值
应在1.5±
0.5范围内。
阳性对照抗体效价应在1:
1024±
1滴度以内,阴性对照血清抗体
效价应＜1:
8。
2.病毒抗原对照平均OD492nm
值50%计算（临界值）
抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以
2,即50%对照值。
该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。
3.结果判定
以病毒抗原对照平均OD492nm
值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临
界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时
所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。
例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其
50%为0.60。
若某一待检血清在1:
128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为
128
若临界值处于两个滴度之间
如处于1：
64与1：
128之间，则抗体滴度取中间
值为1:
9O。
定性检测中
两个重复孔只要有
一孔为阳性孔
则抗体滴度判
定为
128,
两孔均为阳性孔
则判定
为抗体滴度＞1:
ELISA抗体效价≥1:
128,判定为亚洲
型口蹄疫抗体阳性。
ELISA抗体效价与保护力的关系:
牛、羊:
抗体效价≥1:
128,99%
保护；
效价≤1:
16,
不保护；
效价在1:
22-90之间,50%保护。
猪瘟抗原检测试剂盒
Classical
Swine
Fever
Virus
Antigen
Test
kit（CSFVAg）
概述
猪瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、边界病病毒（BDV）都是瘟病毒科黄病毒
属的成员。
猪瘟病毒自从成为一种重要的病原体以来，给养猪业造成了巨大的经济损失，并引起
猪的严重死亡。
感染高致病力猪瘟病毒后，猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。
耐过
急性或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒。
低致病力温和病毒会造成猪的隐性感
染，病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。
怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感
染胎儿。
先天性感染可能导致流产，木乃伊胎儿，死产和/或弱仔及畸形胎儿。
先天性感染
低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排
毒。
猪也有可能感染BVDV或BDV。
尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的，但将
它们同猪瘟病毒有效区分是很重要的。
原理
本ELISA检测试剂盒是用来检测外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的
猪瘟病毒抗原。
采用双抗体夹心ELISA，将CSFV单克隆抗血清包被微量反应板，可与样品
中的CSEV抗原结合。
猪瘟病毒的特异性单克隆抗体形成了夹心的上层。
形成的单克隆抗
体+样品+单克隆抗体夹心可以用辣根过氧化物酶标记物检测。
加入与辣根过氧化物酶反应
的底物，在酶的作用下形成有色产物。
通过酶标仪测定其吸光度。
可以用450nm单波长或
450nm与620m双波长测定各孔吸光度。
试剂
本试剂盒采用96孔板，可以一次检测92个样品（每个样品1孔，每个对照2孔）或46个样
品（每个样品2孔，每个对照2孔）；
或分6次使用，每次用2个板条，设2个对照，测定6个样
品（每个样品2孔）。
为了检测结果的准确性，最好每个样本都设重复。
试
剂数
量
1、多克隆羊抗血清包被板条8孔×
12条（96孔）
2、10倍浓缩样品稀释液（10x）55ml
足以配制550mL直接使用的1x稀释液
3、10倍浓缩洗涤液（10x）125ml
足以配制1、25L直接使用的洗涤液工作浓度（1x）
4、CSFV单克隆抗体，含防腐剂4ml
5、阳性对照，含有防腐剂1.5ml
6、阴性对照，含有防腐剂1.5ml
7、100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物（100x），
辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含有防腐剂200μl
8、酶标抗体稀释液15ml
9、底物液，TMB/H2O2溶液12ml
10、终止液，1M
HCI（小心，强酸）12ml
注意事项
1、仔细阅读并遵守操作说明；
2、试剂盒试剂于2～7℃冷藏保存。
建议将浓缩的洗涤液（10x）保存在18～25℃室温，
以免形成结晶。
3、所有试剂在使用前必须恢复至室温。
4、未使用的包被板应该密封保存在配备的塑料袋中，于2～7℃冷藏保存。
5、不要将不同批次的说明书以及试剂盒成分混合使用。
6、注意防止真菌或细菌污染试剂盒成分。
处理试剂时要小心。
7、不要用超过保质期的检测试剂盒。
8、进行样品或试剂操作时严禁吃东西、喝水或吸烟。
9、每个样品都用单独的吸头。
10、每一批次的试剂必须用其配备的阴阳对照。
11、配制试剂时只能用超纯水。
12、不要用嘴吸取液体。
13、底物溶液和浓缩的样本稀释液对眼睛、呼吸系统和皮肤有剌激性，避免与皮肤和
眼睛接触。
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