慢病毒包装浓缩纯化滴度实验步骤文档格式.docx

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3.第二天，镜下检查细胞。

细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。

4.转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

5.取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168μgpCD/NL-BH*DDD包装质粒和84μgpLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。

另一支中加入500μlTrans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。

将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤：

推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6.室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

7.取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。

来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。

每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

8.6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。

9.转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。

如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

10.将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。

在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11.收集所有的上清，分装到50ml离心管中。

12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13.总的上清约为204ml，用250-ml0.45μmPVDF过滤装置过滤。

如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

慢病毒的浓缩与纯化

方法一超速离心沉淀法

1.取6个Ultra-clearSW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。

2.每个Ultra-clearSW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。

3.取一支10ml的移液管，吸取12ml20%的蔗糖溶液。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4ml。

同样地，将剩下8ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

4.用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。

5.按次序将所有6个离心管放入BeckmanSW28超速离心转头中。

7.小心将管子从转头中取出。

倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。

吸掉剩余的液滴。

在管底应当有可见的沉淀。

8.每管中加入100ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀。

9.将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

12.用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

避免产生泡沫。

将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。

13.集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80℃。

方法二PEG-8000浓缩法

PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。

5XPEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g;

PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；

121摄氏度30min湿热灭绝30min；

保存在4℃。

1.使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；

3.每20～30min混合一次，共进行3-5次；

4.4度放置过夜；

5.4度，4000g，离心20min；

6.吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；

7.加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；

8.集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80℃

病毒滴度的测定

稀释计数法

滴度单位：

TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。

”TU”为”transducingunits”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×

105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。

放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

第二天加病毒

在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。

稀释方法如下：

每种病毒准备10个1.5mlEP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。

依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。

吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。

并做好标记。

第三天追加培养液

在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。

第五天观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。

假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。

定量PCR法

病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。

每孔细胞为5×

104个。

接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/mlpolybrene的新鲜培养基。

将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。

在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。

感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI（TakaraMirusBio，终浓度为10U/ml）的新鲜培养基。

在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。

然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。

用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。

用培养基吹洗下，离心收集细胞。

按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。

每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。

用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。

基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。

准备PCR所需的试剂和样品。

为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：

2×

TaqManMasterMix

25μl×

n 

Forwardprimer（100pmolml-1）

0.1μl×

n

Reverseprimer（100pmolml-1）

Probe（100pmolml-1）

H2O 

19.7μl×

n=numberofreactions.例如：

总反应数为40，将1ml2×

TaqManUniversalPCRMasterMix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlH2O混和。

震荡后放在冰上。

为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：

10×

RNasePprimer/probemix

2.5μl×

17.5μl×

TaqManUniversalPCRMasterMix，100μl10×

RNasePprimer/probemix和700μlH2O混和。

在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。

从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。

分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。

另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-templatecontrol）。

分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。

所使用定量PCR仪为ABIPRISM7000定量系统。

循环条件设定为：

50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。

数据分析：

测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。

滴度（integrationunitsperml，IUml-1）的计算公式如下：

IUml-1=（C×

N×

D×

1000）/V

其中：

C=平均每基因组整合的病毒拷贝数 

N=感染时细胞的数目（约为1×

105） 

D=病毒载体的稀释倍数 

V=加入的稀释病毒的体积数 

慢病毒的储存与稀释

慢病毒的储存

1.病毒的运输采用干冰保温，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于一周内用完）。

2.若病毒量较大，需长期保存。

则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱。

一般病毒可以放于-80℃约12个月以上，但若超过6个月后使用，请重新检测病毒滴度。

3.避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。

每次冻融会降低病毒滴度10%。

慢病毒的稀释

需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用D-Hank'

s、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于实验（于一周内用完）。

慢病毒在细胞水平的使用

什么是MOI？

“MOI”为”multiplicityofinfection”的缩写，中文为“感染复数”或“复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TUnumber/cell）。

在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI。

MOI与整合事件以及目的基因的表达相关。

一定范围内，表达水平和MOI呈正相关。

MOI取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。

所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI以及在体（invivo）注射所需病毒量。

若无文献支持，可以通过预实验得到合适的MOI。

实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的MOI和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响。

目的细胞感染预实验及实验体系的放大

实验目的：

确定细胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增强剂Polybrene。

实验材料：

96孔板，1.5mlEP管，长势良好的目的细胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene（10mg/ml），目的细胞培养基等。

第一天：

细胞准备

将长势良好的目的细胞接种到96板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为3×

104~5×

104个/ml，按90μl/孔加入。

接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30~50%之间。

第二天：

病毒感染

感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加Polybrene。

病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1（细胞经过一天的生长数量约为1×

104个/孔，对应的病毒数量为1×

106TU、1×

105TU和1×

104TU）。

每个MOI值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，比例为1：

2000，终浓度为5μg/ml。

换液

感染实验同一天，8-12小时后，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100μl/孔。

第五天：

观察荧光表达情况

在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。

对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟观察的时间，中途可以传代和换液，以保持细胞良好的生长状态。

通过细胞感染的效果，确认目的细胞的感染MOI以及是否需要添加Polybrene。

对于因目的基因较大，载体无法携带标志基因的，可以通过定量PCR来检测目的基因的表达来评估感染效率。

实验体系的放大

正式实验时，由于细胞数量较大，所需的病毒用量也需相应增大。

放大的原则是保持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。

即使这样，正式实验时由于体系的改变，加上预实验的MOI值设置跨度较大，可进行对MOI的再次优化。

MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。

表1.病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值

单孔底面积（cm2）

正常培养体积（μl）

感染时体积（μl）

MOI=1病毒量（TU）

MOI=10病毒量（TU） 

MOI=100病毒量（TU

96孔板

0.3

100

1×

104

48孔板

0.6

200

105

106

24孔板

1.9

500

6×

12孔板

3.8 

1000

107

6孔板

9.5

2000

T25瓶

25

5000

2500

5×

*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。

*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理。