药用植物常见生理生态指标的测定方法0719Word格式文档下载.docx
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早期的植物气体交换测定方法主要在植物光合作用的测定上应用。
最初使用方法为半叶法，即使一半叶片照光，一半不照光，然后比较一定时间后的叶片重量的差异。
仅仅适于室内少量样品的测定，数据粗糙且变异较大，需要配套仪器测定并手工记录环境参数（光照、温度、湿度等）。
约在20世纪40年代发展了气流法，即通过测定流入、流出叶室（含植物样品）气流的CO2浓度差而计算光合速率，但对CO2变化量的测定用酸碱滴定法，比较费时费力。
从20世纪50年代开始，红外CO2气体分析仪法（或光合作用测定仪法）得到充分发展，但植物叶室（或样品室）与红外分析仪分离不易携带。
这些方法因仪器笨重（体积与重量较大）或辅助器较多或适应范围限制（如受交流电源限制）等因素，不能够对大范围内的大量植物快速测定。
近年来，国际上开发了便携式的光合作用测定系统，则在测定速度、精度、适应范围、数据的自动记录与贮存等方面做了革新，成为非常流行的光合作用研究仪器。
这些新开发的光合作用测定系统可同时测定：
光合作用（Pn）、蒸腾作用（E）、气孔导度（gs）、胞间CO2浓度（Ci）、暗呼吸作用（Rd）、水分利用效率（WUE）等，并可以在野外自然状况下控制叶室内的环境条件，测定植物叶片的气体交换参数及其叶温、气温、相对湿度、光照强度、CO2浓度等生态因子参数，测定光合作用的日变化季节变化曲线，光合作用-光响应曲线，光合作用-CO2响应曲线，研究植物叶片的气体交换参数与生态因子参数间的关系。
12．2．1．3 现代常用的仪器设备及基本原理
现在国内外常用的测定植物气体交换的仪器设备主要有美国Li-COR公司LI-6400便携式光合测定仪（如图12．1），该仪器在国内已有300多台，由基因有限公司代理销售和售后服务。
英国ADC公司的LDCLCi超轻型光合作用测定仪；
英国ADC公司的LDCLCprot便携式光合作用/蒸腾测定系统，该仪器在国内上海泽泉科技有限公司负责销售和售后服务。
德国WALZ公司生产的便携式光合作用--荧光测定系统--GFS—3000。
这些仪器的基本原理是一致的。
植物与大气进行气体交换的过程中，引起叶室内CO2和H2O的浓度发生变化。
CO2和H2O可以吸收特定波段的红外辐射（IR），不同浓度的CO2和H2O红外线的吸收强度不同，红外线通过CO2和H2O后能量会发生损耗，其能量的损耗多少与CO2和H2O变化紧密相关。
红外线通过CO2和H2O能量的变化，经电容器接收后，能转变为可以反映CO2和H2O变化的电信号，进而根据仪器的气体流速、叶面积等计算光合速率（暗呼吸速率）与蒸腾速率，气孔导度和胞间CO2浓度等则可通过对蒸腾速率的计算获得。
在记录光合速率（Pn）、蒸腾速率（E）、气孔导度（gs）、胞间CO2浓度（Ci）、暗呼吸速率（Rd）等生理生态参数的瞬间，叶室内的各种感应器同时记录下了叶温、气温、相对湿度、光照强度、CO2浓度等生态因子参数。
12．2．1．4主要操作过程及注意事项（以LI-6400为例）
（1）电池充电
测定前将4块电池充足电；
将电池与充电器连接，插上电源后，电源指示灯和充电指示灯亮，当电池充足电后，充电指示灯熄灭，切断电源，充电完成。
（2）准备新鲜的碱石灰（sodalime）、干燥剂（desiccant）和CO2钢瓶
在校正不能接近0时，则应更换碱石灰和干燥剂。
干燥剂在干燥时为蓝色，吸水后变为粉红色，如果有一半以上变为粉红色，则应更换。
CO2钢瓶，只在需要控制CO2浓度时使用。
（3）连接
1）连接电池和主机。
2）连接叶室和主机。
在连接叶室和主机时注意叶室侧和主机侧的Sample和Reference相对应，有黑色胶带的接口对应Sample侧。
3）连接进气管：
在LI-6400的主机与叶室和分析仪连接好后，需要在主机的进气口连接好进气管和缓冲瓶。
在野外的条件下，可以利用2升以上的可乐瓶，在瓶盖上打两个与进气管直径相同的孔洞，并把进气管通过一个孔洞通入瓶子的底部。
这种做法基本上可以保证光合速率、CO2浓度的稳定性。
如果在室内或温室做实验的时候，由于室内的CO2浓度明显偏高，一般大气CO2浓度在390μmol·
mol-1左右，而室内有的时候可以高达500-1000μmol·
mol-1，这是由于空气不流通造成的，大的浓度伴随人为影响造成的大的浓度波动，将会造成系统浓度波动掩盖了实际的光合速率的变化，在这种情况下，需要制作更大的缓冲，例如大的箱体和空气袋。
注意：
不能采取把进气管放到室外而机器在室内进行实验的方法，因为这样会导致叶室内CO2浓度大大低于叶室外（房间内）的CO2浓度，同时也会产生温度的较大差异，这样可能会造成比较明显的泄露和波动性。
（4）启动仪器
在主机右侧中部有一个黑色按纽开关，在连接好机器硬件后（即把光合仪主机和分析仪叶室连接起来后），确认电池连接好并且电量充足的情况下，即可按此按钮打开机器开关。
机器提示Chamber（叶室）和IRGA（红外线气体分析仪）是否连接好？
确认连接好后，按主机键盘上的字母“Y”确认即可进入系统主菜单（如图12．2）。
从显示上可以看到，第一行是LI-6400光合仪的名称，第二行是系统版本，第三行是用户存储空间已经使用的百分比，如果超过60％，则在测定前将数据转入计算机，删除文件，清空回收站，以确保有足够的
内存空间。
第四行显示的是当前时间和电池电压，如果时间设置不准确，可能影响对数据测量时间的确定。
具体设置方法是在应用菜单中选择“Settimeanddata”，按提示即可设定。
充足电时，电池电压为12．4V，电压在10．8V以下时，仪器会报警，应及时更换电池。
第五行显示的是操作系统主菜单。
包括欢迎菜单WelcomeMenu、配置菜单ConfigMenu、校准菜单CalibMenu、测量菜单NewMsmnts和应用菜单UtilityMenu五个主菜单。
进入配置菜单ConfigurationMenu，可选择光源，叶室等。
（5）校正
由于周围环境条件的变化，仪器的零点会发生变化。
测定前必须完成流量调零和IRGA（CO2，H2O）调零。
首先进行流量调零。
在校准菜单CalibMenu（F3）下，首先选择”Flowmeterzero”后，流量计将关闭，约10秒后，流量信号在1mv以内时（如果流量信号过大或过小，可通过“Adjust↑”与“Adjust↓”键上调或下调），选择f5（OK），按esc键返回校正菜单。
再进行IRGA（CO2，H2O）调零。
按“IRGAZero”，开始IRGA（CO2，H2O）调零，之前应关闭叶室并保持叶室内不夹叶片，而且让气流从碱石灰和干燥剂中通过（将sodalime，desiccant逆时针拧到scrub侧），选择“Y”，等待CO2R，CO2S，H2OR，H2OS稳定调零（至少要等15分钟，一般等20-30分钟，如果难以调零，则要更换碱石灰和干燥剂），选择”AutoAll”键，CO2R，CO2S，H2OR，H2OS全部稳定调零，按Quit返回校正菜单。
校正完成后，关闭碱石灰和干燥剂开关（将sodalime，desiccant顺时针拧到bypass侧）。
（6）环境控制
进入测量菜单NewMsmnts，可对流量（Flow），CO2浓度（Mixer），温度（Temp），光照强度进行控制。
流量控制：
一般情况下，流量控制意义不大，原则是在光合比较弱的情况下，可以把流量设得小一点以降低波动造成的误差，而在光合比较强的情况下，可以把流量调得大一些。
默认条件下，流量为500μmol·
s-1。
按功能键F2进入流量控制。
选择“Flowrate”菜单行并继续输入流量数值（LI-6400的流量控制范围是0-700μmol·
s-1）。
CO2浓度控制：
CO2浓度的控制对于光合作用方面的研究非常重要。
例如，我们可以通过A-Ci曲线来研究植物一些重要的生理指标，如CO2补偿点、CO2饱和点、羧化效率等，也可以通过控制CO2浓度来提高测量准确性，降低误差。
具体的方法如下：
首先在校准菜单下进行CO2mixercalibration。
在测量菜单下，按F3（Mixeroff）功能键进入CO2浓度控制菜单。
选择其中REFCO2400μmol·
mol-1一行后回车。
并在弹出窗口中输入需要控制的CO2浓度。
回车后在该控制菜单的左面出现一个*号，直到控制的浓度完全达到后*号就会消失。
这时叶室内CO2浓度就与输入的浓度值相同了。
温度控制：
温度的控制对于光合研究也至关重要。
具体的控制方法是在测量菜单下，按功能键F4（Tempoff）进入温度控制，选择BlockTemp20．0℃菜单行后回车。
输入需要控制的温度后回车就可以了。
光强控制：
光强对于光合速率影响非常大，按功能键F5（Lampoff）进入光强控制。
选择QuantumFlux一行后回车，继续输入需要设置的光强即可把光强控制到相应的光合有效辐射强度了。
湿度的控制：
通过调节干燥剂开关可控制叶室内的湿度。
以上环境条件可以根据实际工作的需要来进行控制。
在设定好环境条件后，夹上植物叶片等待稳定后即可测定记录数据了。
（7）测定
1）常规测定
进入测量菜单NewMsmnts，按“OpenLogFile”下边的功能键F1来建立新的文件。
之后回车，这时机器界面显示中“OpenLogFile”改为“Log”。
需要注意的是，在夹入叶片之前，应该首先闭合叶室后查看仪器显示屏的参数中△CO2是否为零，如果不为零，说明此时分析仪的参比室和样品室的测量数值不相同（因为两个分析室毕竟是分开的，有可能随着时间的推移而形成测量的漂移），这时需要按“Match”下边的F5功能键来匹配两个分析室。
继续按MATCHIRGA下边的F5功能键，等待匹配后，按EXIT下边的F1功能键来退出匹配程序。
测量时，选取好叶片后夹入叶室，并顺时针旋转手柄和叶室中间的固定螺丝直到叶室紧密闭合。
等待参数中△CO2和PHOTO（净光合速率）值保持不变的情况下，即可按“LOG”下的F1功能键来记录数据，也可以按手柄左边的黑色按钮来记录数据（需要按住两秒种）。
按（Closefile）保存数据。
测量后打开叶室，换上其他叶片继续测量即可。
用以上方法，通过手工设定环境条件，也可以测定光响应曲线（Light-Curve）和CO2响应曲线（ACi-Curve）。
2）自动测定
①光响应曲线：
光响应曲线是研究植物叶片在其他环境条件保持不变的情况下，光合速率随光合有效辐射强度的改变而发生变化的情况。
通过测量得到的光响应曲线，可以进一步计算得到光补偿点、光饱和点、最大光合速率、表观量子效率等重要参数。
测定方法是：
按F1功能键，进入自动测量程序子菜单（AutoProgram）。
选择其中”Lightcurve”来进入光响应曲线自动程序。
接下来系统会要求首先输入光强变化梯度，以空格相连。
一般情况下，我们应该从高到低来输入这个梯度。
接下来系统会要求输入最小等待时间和最大等待时间以及匹配差值。
可以按照默认输入直接回车就可以了。
如果有足够的经验来确定这些配置，也可以自行进行时间上的调节。
这时菜单最左边会出现一个*，说明目前自动测量程序状态正在运行。
直到*号消失，说明程序结束。
在测定中可以看已测定的数据，按F2功能键进入ViewFile菜单，继续按F1功能键进入“QuickConfig”菜单，选择其中“Lightcurve”进入查看测量得到的光响应曲线的图形。
②CO2响应曲线：
CO2响应曲线是研究植物叶片在不同CO2浓度下光合速率的响应。
可以在测量菜单下进入自动测量程序（AutoProgram）。
选择“ACicurve”。
回车进入选择状态。
继续输入CO2浓度变化梯度。
输入最小等待时间和最大等待时间，如果没有足够的经验，按默认值直接回车确认。
之后系统将自动进行ACi曲线测量。
需要注意的是，如果使用了光源叶室，注意在测量之前给定光强。
由于不同光强下的ACi曲线是不一样的。
一般情况下，常采用饱和光强测量。
有的时候，也许会需要做不同光强下的ACi曲线实验来进行分析。
（8）休眠退出
LI-6400光合仪同时具有休眠功能。
在应用菜单（f5）最后一行选择“Sleepmode”之后回车。
在继续按字母“Y”确认后，这时机器处于休眠状态，可以在此时进行叶室的更换工作或在测量结束休眠一会儿，然后继续做实验。
重新激活只需要按任意键即可。
测定全部结束后，关闭电源，将电池取出充电。
（9）数据传输
首先在LI-6400开机以前，利用随机带的数据线把计算机与LI-6400连接起来再开机。
开机后，按F5功能键进入应用菜单，选择“FileExchangeMode”。
这时在计算机一端启动LI-6400File程序，点击“Connect”连接。
我们可以看到左边是计算机中的文件系统，右边是LI-6400内的文件系统，利用鼠标左键选择需要复制的文件，拖到左边计算机中准备放置这个文件的文件夹中。
如果需要从LI-6400中删除这个文件，只需要选中文件后按右侧下边的回收站的图形，就可以删除这个文件了。
LI-6400数据文件格式是．dat格式。
如果需要打开进行编辑，可以首先打开Excel程序，并把打开文件格式的扩展名选择为“所有文件”。
然后选择利用分隔符—逗号分隔就可以了。
这样就可以进一步处理数据了。
（10）文件删除
在主菜单下，按F5功能键进入UtilityMenu。
选择其中AccesstheFILER进入文件管理器。
移动光标选择需要删除的文件，按F4功能键对准备删除的文件进行标记。
接下来选择TagAll或TagOne来选择标记当前选择的文件还是标记所有的文件。
选择后，继续按F5功能键Purge来删除文件。
这时该文件被删除到回收站Trash中。
可以按左侧的“Label”键来翻动菜单。
直到翻到“Trash”出现为止。
按F2功能键清空回收站中的文件。
使用这个功能之前请确认已经把这个文件保存在计算中或者不需要这个文件了，否则一删除就无法恢复了。
12．2．2植物叶绿素荧光的测定
12．2．2．1叶绿素荧光的测定原理及主要参数的意义
植物组织内的叶绿素吸收光能并用来驱动光合作用，超出植物所利用部分的能量以叶绿素荧光或热量的形式释放出去。
叶绿素分子在接收到一定波长的光照辐射后处于激发态，激发态的叶绿素分子能发出短时间内以能量形式存在的波长较长的荧光，这种效应称为荧光效应，波长较长的光称为叶绿素荧光。
植物光合作用速率的改变会大大影响叶绿素荧光的释放。
在一定的外界环境温度下，绝大多数叶绿素荧光是在光系统Ⅱ的转动过程中释放的，健康的叶子经过一段时间的黑暗处理后突然照光，可观察到随时间变化的叶绿素荧光的产生，这一现象称为Kautsky效应（荧光感应），这时荧光强度与光照强度成正比。
通常情况下，健康植物约需10-30min来适应黑暗处理。
叶绿素荧光信号包含了十分丰富的光合作用过程变化的信息，因而它被视为植物光合作用与环境关系的内在探针，许多学者已将这项技术应用于农业、林业、园艺作物研究中。
叶绿素荧光测定的原理如下图12．3所示，在暗适应条件下，测定的Fo表示PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量，称为最小荧光产量，也叫固定荧光、初始荧光、基础荧光、0水平荧光，Fo的大小主要取决于PSⅡ天线色素内的最初激子密度、天线色素之间以及天线色素到PSⅡ反应中心的激发能传递机率的结构状态，它与叶片叶绿素浓度有关；
最初的荧光Fo照光开始后即可达到，这是植物完全适应黑暗环境后的基础荧光水平。
在这种状态下，大多数光系统Ⅱ反应中心是开放的，且原初电子受体QA库被大量消耗，光合作用强度
降低所致（叶绿素捕获的未被利用的能量以荧光形式释放。
光照越强，QA库减少越快，直到可变荧光Fv达到最大值，植物处于光饱和状态，此时的荧光峰值定义为Fm。
Fm表示PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，称为最大荧光产量；
Fv（Fv=Fm-Fo）称为可变荧光；
Fv/Fo常用于表示植物叶片PSⅡ潜在活性；
Fv/Fm是PSⅡ最大光化学量子产量，反映PSⅡ反应中心内禀光能转换效率，也叫最大PSⅡ的光能转换效率，在非胁迫条件下，该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响；
胁迫条件下该参数明显下降。
在光照条件下，测定实际荧光产量（Ft）和最大荧光产量（Fm’）。
ΔF/Fm’表示PSⅡ实际光化学量子产量，它反映开放的PSⅡ反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率，其中ΔF=Fm’-Ft，叶片不经过暗适应在光照下直接测得。
ETR是表观光合电子传递速率，即ETR＝ΔF/Fm’×
PAR×
0．5×
0．84，其中PAR为光合有效辐射（μmol．m-2．s-1），系数0．5表示传递1个电子需要吸收2个光量子，系数0．84表示在入射的光量子中被吸收的占84%。
荧光猝灭分两种：
光化学猝灭和非光化学猝灭。
光化学猝灭以光化学系数表示，即qP=（Fm’-Ft）/（Fm’-Fo）。
非光化学猝灭反映PSⅡ天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分，有两种表示方法，即NPQ=Fm/Fm’-1；
qN=1-（Fm’-Fo）/（Fm-Fo）。
确切测定Fo及Fm需要一种快速转变的测定装置及强光刺激。
这样，可变荧光Fv就计算出来（Fv＝Fm-Fo），比值Fv/Fm也因此得出，其代表光系统Ⅱ量子产量或量子效率。
Fv/Fm与光化学作用的产量成正比，并且与净光合的产量也密切相关，而净光合速率是验证光能有效性的最好方法。
相反，在黑暗条件下，Fv/Fm下降程度的差异，能够指示逆境条件（如干旱、盐分胁迫及环境污染植物等）对植物光合作用系统抑制的程度。
测定叶绿素Fo荧光与Fm曲线之间的面积，还可提供光系统Ⅱ中电子受体库信息。
当反应中心到质休醌库之间的电子传递被堵塞时，该面积将大大减少，这种情况可见于环境污染及施用除草剂后植物的荧光反应。
因此测定叶绿素荧光，实际上是对植物生理生态性能的综合诊断。
12．2．2．2测定的意义
1）植物生理生态学研究 通过测定植物随光照强度、黑暗处理、除草剂等环境因子的影响而发生的叶绿素荧光的变化，获取植物光合作用强度、光合有效辐射、电子受体库大小等生理参数，从而深入研究植物光合作用及其相关的光化学反应等生理过程。
在盐渍环境下，可测定不同盐分浓度下的叶绿素荧光量，以揭示与之相应的光合作用变化；
在其他逆境条件（如干旱、低温、高温、风暴等）下，也可以利用该技术进行相应的生理生态学研究。
2）农业科学研究 通过植物叶绿素荧光测定，选择植物适宜的生长环境（尤其是光环境），排除可能对植物光合作用产生抑制的环境条件，从而达到提高产量的目的。
在农业化学方面，运用该技术筛选对植物光合作用系统破坏最有效的除草剂；
在遗传育种方面，筛选对某些除草剂具抗性的作物品种；
在农学方面，早期预报环境压力及养分的缺乏状况。
所有这一切，植物叶绿素荧光技术均可能提供一种理想的研究手段。
3）森林生态研究 用叶绿素荧光研究森林生态系统中优势树种光合作用的变化，从而预报虫害，干旱气候及火灾等引起森林衰退，便于及早采取措施。
在正常的森林生态系统中，研究不同树种的叶绿素荧光特征值，也是一项十分重要的基础生理生态学和背景值研究。
4）大气污染及全球变化研究 环境中的大气污染如SO2、NOx、O3、HF、Cl2等对植物叶绿素成分产生破坏，使光系统Ⅱ中电子受体受损，电子传递因此受阻，光合作用下降，从而使植物释放荧光强度发生变化；
另外，叶绿素的破坏可造成植物释放荧光的实际面积减少，测定该面积的叶绿素荧光变化可以用来有效地指示大气污染对植物的危害程度。
在全球变化生态研究方面，测定高CO2浓度及温度上升植物叶绿素荧光的变化，还可以探讨植物对全球变化光能利用方面的特点。
12．2．2．3叶绿素荧光仪
用于测量植物释放的叶绿素荧光的仪器称为叶绿素荧光仪（chlorophyllfluorescencemeter）。
植物在光合作用过程中释放的叶绿素荧光一系列荧光值Fo，Fm，以及由这些值而
计算的光系统Ⅱ量子产量（Fv/Fm），光化学猝灭（qP），非光化学猝灭（qN）等可由仪器给出。
英国Hanstaeck公司生产的叶绿素荧光仪又称植物效能计，可对植物的生长状态进行综合的分析，可测得Fo，Fm，量子产量（Fv/Fm）等指标。
该公司的新一代产品PMFS2/2以及德国Walz公司生产的PAM-2000及PAM-2100（图12．4）则可以测定除这些指标外的光化学猝灭和非光化学猝灭等参数。
12．2．2．4主要操作过程及注意事项（以PAM-2100为例）
（1）充电
测定前要充足电。
连接电源，通过充电器2120-N对内置电池进行充电时，红灯亮。
当电池充满后，绿灯亮，即可停止充电，切断电源。
（2）连接
包括光纤连接和叶夹连接。
特制光纤2010-F在一个特制插头的帮助下可以连接到PAM-2100的前部（仪器右侧）。
光纤有三个光学直径不同的末端，在插头的帮助下分别接入对应的插孔中与相应的光学装置相连。
光纤的另一端连接到叶夹上。
当测量光照下叶片的叶绿素荧光时，仪器提供一个“距离叶夹”（DistanceClip），通过该叶夹可调节光纤末端与叶片之间的相对距离。
光纤应轻拿轻放。
光纤（特别是与主控单元相连的末端部位）不能被过度弯曲，否则可能会导致光纤破损从而影响信号精度。
光纤被钢制螺旋和塑料覆盖，在一定程度上避免了过度的弯曲。
光纤不用时，应及时盖上光纤两端的橡胶帽，以防弄脏接头，影响测定精度。
叶夹连接是将叶夹上的插头连接到仪器上。
仪器上有四个连接插孔（LEAFCLIP、RS232、EXT．DC和EXT．HALOGEN）不能连错。
不能将插头接到错误的插孔里。
插头和插孔上的红点指示了连接方向。
不要通过拽电缆来拔出插头，
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