第六章 微生物的生长及其控制文档格式.docx

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培养后，每一活细胞就形成一个单菌落，即“菌落形成单位”（cfu），根据每皿上形成的cfu数乘上稀释度就可推算出菌样的含菌数。

此法最为常用，但操作较烦琐且要求操作者技术熟练。

国外已出现多种微型、快速、商品化的用于菌落计数的小型纸片或密封琼脂板。

主要原理：

利用加在培养基中的活菌指示剂TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑），使菌落在很微小时就染成易于辨认的玫瑰红色。

2.液体稀释法

对未知菌样作连续的10倍梯度稀释。

根据估计数，从最适宜的3个连续的10倍稀释液中各取5ml试样，接种到3组共15支装有培养液的试管中（每管接入1ml）。

经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN（最大可能数）表，再根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。

（三）其他计数法

1.比浊法

这是测定无色菌悬液中总细胞数的快速方法。

在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度（O.D.）成正比，可借助于分光光度计在一定波长（450nm～650nm）下测量菌悬液的光密度，对照标准曲线求出菌液浓度。

此法虽然灵敏度较差，然而却具有简便、快速、不干扰或不破坏样品的优点。

2.膜过滤法

用于测定量大、含菌浓度低的流样样品（如水、空气等）。

主要操作：

将定量的样品通过膜过滤器，菌体便被阻留在滤

膜上，然后将滤膜放在培养基上培养。

计算其上的菌落数，求出样品中的含菌数。

二、微生物生长量的测定

适用于一切微生物。

（一）直接法

1.测体积法

是一种粗放的方法，用于初步比较。

例如把待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察其体积。

2.称重法

包括湿重法和干重法。

微生物的干重一般为其湿重的10％～20％。

此法适用于菌体浓度较高的样品，并要求除尽杂质。

（二）间接法

1.含氮量测定法

一般微生物细胞的含氮量比较稳定，可用凯氏定氮法等测其总氮量，再乘以系数6．25即为粗蛋白含量。

蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。

2.DNA含量测定法

微生物细胞的DNA含量较稳定，可采用适当的荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用，利用荧光比色或分光光度计法测得DNA的含量。

3.其他生理指标法

如测定碳、磷、RNA、ATP、DAP（二氨基庚二酸）等的含量。

此外，产酸、产气、耗氧、粘度和产热等指标，有时也应用于生长量的测定。

三、丝状微生物菌丝长度的测定

通过测定菌丝的长度变化来反映它们的生长速率。

方法：

（一）培养基表面菌体生长速率测定法

主要测定一定时间内在琼脂培养基表面的菌落直径的增加值。

（二）培养料中菌体速率测定法

主要测定一定时间内在固体培养料（如栽培食用菌的棉籽壳麸皮培养料）中菌丝体向前延伸的距离。

（三）单个菌丝顶端生长速率测定法

可在显微镜下借助目镜测微尺测定在一定时间内单个菌丝的伸长长度。

★第二节微生物的生长规律

一、微生物的个体生长和同步生长

研究某一细胞变化，目前能使用的方法：

一是用电子显微镜观察细胞的超薄切片，

二是使用同步培养技术，即设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。

通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长。

获得微生物同步生长的方法：

选择法和诱导法。

1.选择法

是一类根据微生物细胞在不同生长阶段体积与重量不完全相同的原理设计的方法，以膜洗脱法较有效、常用。

（1）离心分离法

将不同步的细胞悬浮在不被该菌利用的蔗糖溶液或葡聚糖液中，通过密度梯度离心将大小不同的细胞分成不同区带，分别取出培养，便可得到同步生长细胞。

（2）过滤分离法

利用孔径不同的微孔滤膜可将大小不同的细胞分开。

选用适当孔径的微孔滤膜只允许个体较小的刚分裂的细胞通过滤膜，收集后培养即可获得同步培养物。

★（3）膜洗脱法

将异步生长的菌液通过垫有硝酸纤维薄膜的滤器，不同生长阶段的细菌均吸附于膜上，然后翻转滤膜，用无菌的新鲜培养液慢速洗脱，最初流出的是未吸附的细胞，不久，膜上细胞开始分裂，分裂后的子细胞有的不与膜接触易随培养液流下。

若滤膜面积足够大，只要收集刚滴下的子细胞培养液即可获得满意的同步生长的细胞。

2.诱导法

主要是通过控制环境条件如温度、营养物或能够影响周期中主要功能的代谢抑制剂等诱导细胞同步生长。

主要有：

（1）控制温度

通过最适生长温度与允许生长的亚适温度交替处理可使不同步生长细胞转为同步分裂的细胞。

在亚适温度下细胞物质合成照常进行，但细胞不能分裂，使群体中分裂准备较慢的个体赶上其他细胞，再换到最适温度时所有细胞都同步分裂。

（2）控制培养基成分

将不同步生长营养缺陷型细胞在缺少主要生长因子的培养基中饥饿一段时间，细胞都不能分裂，再转到完全培养基中就能获得同步生长细胞。

如大肠杆菌胸腺嘧啶缺陷型菌株在缺少胸腺嘧啶时DNA合成停止，但RNA和蛋白质合成不受影响，30min后加入胸腺嘧啶，DNA合成立即恢复，40min后几乎所有细胞都进行分裂。

将不同步菌液在有一定浓度抑制剂（如氯霉素）的培养基里培养一段时间后再接到另一完全培养基中，获得同步生长细胞。

保持同步生长的时间因菌种和条件而变化。

由于同步群体内细胞个体的差异，同步生长最多只能维持2～3代，又逐渐变为随机生长。

★二、单细胞微生物的典型生长曲线

定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线（growthcurve）。

微生物的典型生长曲线：

把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中，在适宜的温度、通气等条件下，该群体就会由小到大，发生有规律的增长。

如以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可画出一条由延滞期、指数期、稳定期和衰亡期4个阶段组成的曲线，这就是微生物的典型生长曲线。

它只适合单细胞微生物如细菌和酵母菌。

对丝状生长的真菌或放线菌而言，只能画出一条非“典型”的生长曲线，例如，真菌的生长曲线大致可分为3个时期，即生长延滞期、快速生长期和生长衰退期。

典型的生长曲线与非典型的丝状菌生长曲线两者的差别：

后者缺乏指数生长期，与此期相当的只是培养时间与菌丝体干重的立方根成直线关系的一段快速生长时期。

根据微生物的生长速率常数，即每小时分裂次数（R）的不同，一般可把典型生长曲线粗分为：

延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期。

微生物的典型生长曲线

Ⅰ.延滞期，Ⅱ.指数期，Ⅲ.稳定期，Ⅳ.衰亡期

（一）延滞期（lagphase）（停滞期、调整期或适应期）

指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目没有增加的一段时间。

特点：

1生长速率常数为零；

2细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状，如巨大芽孢杆菌在接种时，细胞仅长3.4μm，而培养至3h时．其长为9.1μm，至5.5h时，竟可达19.8μm；

3细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；

④合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱导酶；

⑤对外界不良条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。

影响延滞期长短的因素：

菌种的遗传性、接种龄、接种量及移种前后所处的环境条件等。

在发酵工业上采取措施缩短延滞期有重要意义：

增加培养基营养、采用最适种龄的健壮菌种（处于指数期的菌种）接种、加大接种量都可缩短延滞期和发酵周期，提高设备利用率。

出现延滞期的原因，是由于接种到新鲜培养液中的种子细胞，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物。

为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物，就需要有一段用于适应的时间，此即延滞期。

（二）指数期（exponentialphase）/对数期（logarithmicphase）

，指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。

①生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间——代时（generationtime，G，又称世代时间或增代时间）或原生质增加一倍所需的倍增时间最短；

②细胞进行平衡生长，故菌体各部分的成分十分均匀；

③酶系活跃，代谢旺盛。

3个重要参数为：

n、R、G

设对数期t1时刻的菌数为x1，经过n次分裂后，t2时刻的菌数为x2。

（1）繁殖代数（n）

由1个细胞分裂成为2个细胞的间隔被称为世代

x2＝x1·

2n

n＝（lgx2－lgx2）/lg2＝3.322（lgx2－lgx2）

（2）生长速率常数（R）

单位时间内所产生的世代数（每小时分裂次数）

R＝n/（t2－t1）＝［3.322（lgx2－lgx2）］/（t2－t1）

（3）代时（G）

繁殖一个世代所需的时间，因而也就是群体细胞数目扩大1倍所需的时间，有时也被称为倍增时间。

G＝1/R＝（t2－t1）/［3.322（lgx2－lgx2）］

影响指数期的因素：

1.菌种：

不同菌种的代时差异极大

2.营养成分：

营养越丰富，代时越短

3.营养物浓度：

影响微生物的生长速率和总生长量（生长限制因子）

4.培养温度：

影响微生物的生长速率

不同菌种指数期的代时不同，同一菌种在不同培养条件下，代时也不同。

培养基营养丰富，培养温度适宜，代时较短；

反之则长。

意义：

1.指数期的微生物具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是用作代谢、生理等研究的良好材料。

2.是增殖噬菌体的最适宿主。

3.是发酵工业中用作种子的最佳材料。

（三）稳定期（stationaryphase）（又称恒定期或最高生长期）

①活细胞总数维持不变，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最高点。

②细胞生长速率为零

③细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞成分合成缓慢，G+染色发生变化。

稳定期到来的原因是：

1营养物尤其是生长限制因子的耗尽；

2营养物的比例失调，例如C／N比不合适等；

3酸、醇、毒素或H202等有害代谢产物的累积；

④pH、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜；

等等。

稳定期对生产实践的重要指导意义：

①对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物（SCP、乳酸等）为目的的某些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期；

②进入稳定期，细胞内开始积累糖原、异染颗粒和脂肪等内含物对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定来说，稳定期是最佳测定时期；

③某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；

④此外，通过对稳定期到来原因的研究，还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。

（四）衰亡期（declinephase或deathphase）

①细胞死亡速率超过新生速率，R为负值，整个群体呈现负生长状态；

②细胞变形退化，有的发生自溶，G+染色发生变化；

③释放芽孢和次生代谢产物。

产生衰亡期的原因：

外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢．继而导致大量菌体死亡。

影响衰亡期的因素：

①与菌种的遗传特性有关:

有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡,有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；

②与是否产芽孢有关：

产芽孢的细菌更易于幸存下来；

③与营养物质和有毒物质有关：

补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。

三、微生物的连续培养

连续培养又称开放培养，是相对于上述绘制典型生长曲线时采用的那种分批培养或密闭培养而言的。

当微生物以分批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气，并立即搅拌均匀；

另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。

于是容器内的培养物就可达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率上，于是形成了连续生长。

连续培养装置：

恒浊器和恒化器。

恒浊器：

是根据培养液细胞密度调节培养液流入的速率，使装置内细胞密度保持恒定。

细胞密度通过光电控制系统调节。

恒化器：

通过控制某种限制性营养物质（生长限制因子）的浓度调节微生物的生长及其细胞密度，使装置内营养物质浓度恒定。

恒浊器与恒化器的比较

装置

控制对象

生长限制因子*

培养液流速

生长速度

产物

应用范围

恒浊器

菌体密度

（内控制）

无

不恒定

最高生长速度

大量菌体或与菌体生长相平行的代谢产物

生产为主

恒化器

（外控制）

有

恒定

低于最高生长速度

不同生长速度的菌体

实验室为主

生长限制因子：

凡处于较低浓度内可影响生长速率和菌体产量的某营养物就称为生长限制因子。

连续培养的优点：

微生物能在比较恒定的环境中以恒定的速率生长，有利于研究生长速率（或营养物质）对细胞形态、组成和代谢活动的影响，可筛选出新的突变株；

连续培养在生产上可缩短生产周期，提高设备利用率，提高发酵工业的效益，便于自动化生产，减轻劳动强度，已成为当前发酵工业的方向。

缺点：

营养物质利用率低，杂菌易污染，菌种易退化。

第三节影响微生物生长的主要因素

主要讨论温度、氧气和pH。

一、温度

生长温度的三基点：

最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度

根据最适生长温度的不同可将微生物分为三类：

嗜冷菌、嗜温菌和嗜热菌。

微生物的生长温度类型

微生物类型

生长温度范围℃

分布区域

最低

最适

最高

嗜冷菌

专性嗜冷型

－10

5～15

15～20

海洋深处、南北极、冰窖

兼性嗜冷型

－5～0

10～20

25～30

海洋、冷泉、冷藏食品

嗜温菌

室温型

20～35

40～45

腐生环境

体温型

35～40

寄生环境

嗜热菌

25～45

50～60

70～95

温泉、堆肥、土壤

最适生长温度经常简称为“最适温度”，涵义为某种微生物分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。

对同一种微生物，最适生长温度并非一切生理过程的最适温度，即最适温度并不等于生长得率最高时的培养温度，也不等于发酵速率或累积代谢产物最高时的培养温度，更不等于累积某一代谢产物最高时的培养温度。

例如粘质赛氏杆菌的生长最适温度为37℃，而其合成灵杆菌素的最适温度为20～25℃；

黑曲霉生长最适温度为37℃，而产糖化酶的最适温度则为32～34℃。

这一规律对发酵生产有重要意义：

在产黄青霉总共165h的青霉素发酵过程中，根据不同生理代谢过程有不同最适温度的特点，分成4段进行不同温度培养。

具体做法是：

接种后在30℃下培养5h，将温度降至25℃培养35h，再下降至20℃培养85h，最后又升温至25℃培养40h后放罐。

结果，其青霉素产量比常规的自始至终进行30℃恒温培养的对照组竟提高了14.7％。

二、氧气

粗分成好氧微生物（好氧菌，aerobes）和厌氧微生物（厌氧菌，anaerobes）两大类，并可进一步细分为5类。

（一）好氧菌

好氧菌又可分为专性好氧菌、兼性厌氧菌和微好氧菌3类。

1.专性好氧菌

必须在较高浓度分子氧的条件下才能生长，它们有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，具有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶，绝大多数真菌和多数细菌、放线菌都是专性好氧菌。

振荡、通气、搅拌都是实验室和工业生产中常用的供氧方法。

2.兼性厌氧菌

以在有氧条件下的生长为主也可兼在厌氧条件下生长的微生物，有时也称“兼性好氧菌”。

它们在有氧时靠呼吸产能，无氧时则借发酵或无氧呼吸产能；

细胞含SOD和过氧化氢酶。

它们在有氧条件下比在无氧条件下生长得更好。

3.微好氧菌

只能在较低的氧分压下才能正常生长的微生物。

也是通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。

（二）厌氧菌

厌氧菌又可分为耐氧菌和（专性）厌氧菌。

1.耐氧菌

是耐氧性厌氧菌的简称。

是一类可在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活的厌氧菌。

它们的生长不需要任何氧，但分子氧对它们也无害。

它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵和底物水平磷酸化而获得能量。

耐氧的机制：

细胞内存在SOD和过氧化物酶（但缺乏过氧化氢酶）。

2.厌氧菌

有一般厌氧菌与严格厌氧菌（专性厌氧菌）之分。

①分子氧对它们有毒，即使短期接触也会抑制甚至致死；

②在空气或含10％CO2的空气中，它们在固体或半固体培养基表面不能生长，只有在其深层无氧处或在低氧化还原势的环境下才能生长；

③生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；

④细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。

三、pH

与温度的三基点相似，不同微生物的生长pH也存在最低、最适与最高3个数值。

不同种类微生物有其最适生长pH，同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程，也有不同的最适pH要求。

这一规律，对发酵生产中pH的控制尤为重要。

虽然微生物外环境的pH变化很大，但细胞内环境中的pH却相当稳定，一般都接近中性。

这就免除了DNA、ATP、菌绿素和叶绿素等重要成分被酸破坏，或RNA、磷脂类等被碱破坏的可能性。

与细胞内环境的中性pH相适应的是，胞内酶的最适pH一般都接近中性，而位于周质空间的酶和分泌到细胞外的胞外酶的最适pH则接近环境的pH。

pH除了对细胞发生直接影响之外，还对细胞产生种种间接的影响：

影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响环境中有害物质对微生物的毒性，以及影响代谢反应中各种酶的活性等。

★培养基的原始pH值会在培养微生物的过程中发生改变的原因，可能反应有以下数种：

在一般微生物的培养中变酸往往占优势。

pH的变化还与培养基的组分尤其是碳氮比有很大的关系，碳氮比高的培养基，例如培养各种真菌的培养基，经培养后其pH值常会显著下降；

相反，碳氮比低的培养基，例如培养一般细菌的培养基，经培养后，其pH值常会明显上升。

★调节pH的措施分成“治标”和“治本”两大类

pH调节

治标

过酸时，加入NaOH、Na2CO3等碱液中和

过碱时，加入H2SO4、HCl等酸液中和

治本

过酸时

加适当氮源：

加尿素、NaNO3、NH4OH或蛋白质等

提高通气量

过碱时

加适当碳源：

加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等

降低通气量

第四节微生物培养法概论

良好的微生物培养装置的基本条件是：

按微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条件（厌氧菌除外）；

还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件，并严防杂菌污染等。

微生物培养技术发展的轨迹有以下特点：

⑴从少量培养到大规模培养；

⑵从浅层培养发展到厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养；

⑶从以固体培养技术为主到以液体培养技术为主；

⑷从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；

⑸从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养；

⑹从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化细胞；

⑺从单纯利用微生物细胞到利用动物、植物细胞进行大规模培养；

⑻从利用野生型菌株发展到利用变异株直至遗传工程菌株；

⑼从单菌发酵发展到混菌发酵；

⑽从低密度培养发展到高密度培养；

⑾从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐；

等。

一、实验室的微生物培养法

（一）好氧培养法

1.固体培养法

分为试管斜面、培养皿琼脂平板、较大型的克氏扁瓶及茄子瓶斜面等平板培养方法。

2.液体培养法

实验室进行好氧菌液体培养的方法主要有四种:

试管液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养和台式发酵罐培养。

（1）试管液体培养

装液量可多可少。

此法的通气效果一般较差，仅适合培养兼性厌氧菌。

常用于微生物的各种生理生化试验等。

（2）浅层液体培养

在三角瓶中装入浅层培养液，其通气量与装液量、棉塞通气程度密切相关。

此法一般仅适用于兼性厌氧菌的培养。

（3）摇瓶培养

将装有较少量液体培养基的三角瓶（摇瓶），用8～12层纱布或疏松的棉塞封口以利于通气并阻止空气中杂菌或杂质进入，将摇瓶放置在旋转式或往复式摇床上进行振荡培养。

为使菌体获得充足的氧，一般装液量为三角瓶容积的10％左右，如250ml三角瓶装10～20ml培养液。

摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等，也常在发酵工业中用于种子培养。

（4）台式发酵罐

实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。

商品发酵罐的种类很多，一般都有多种自动控制和记录装置。

如配置有pH、溶解氧、温度和泡沫检测电极，有加热或冷却装置，有补料、消泡和pH调节用的酸或碱贮罐及其自动记录装置，大多由计算机控制。

因其结构与生产用的大型发酵罐接近，所以，是实验室模拟生产实践的重要试验工具。

（二）厌氧培养法

除需要特殊的培养装置或器皿外，首先应配制特殊的培养基。

此类培养基中，除保证提供6种营养要素外，还须加入适当的还原剂，必要时，