基因工程材料文档格式.docx
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1.何谓Klenow片断？
Klenow片断在基因工程中有哪些用途？
（8分）
KlenowDNA聚合酶是E.coliDNApolymeraseⅠ经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'
--3'
外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3'
--5'
外切活性不受影响。
也称为Klenow片段（Klenowfragment），或E.coliDNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coliDNApolymeraseⅠlargefragment）。
它也可以通过基因工程得到，分子量为76kDa。
KlenowDNA聚合酶的活性与E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性是一致的。
由于没有5'
外切活性，使用范围进一步扩大。
①补平3'
凹端DNA。
使用单纯的DNA合成活性。
注意要加足够的dNTP；
如果使用带标记的dNTP，则可对DNA进行末端标记。
②抹平DNA3'
凸端。
在3'
外切活性作用下，可切除突出的3'
注意必须加足量dNTP，否则外切活性不会停止。
但由于T4和T7DNA聚合酶具更强的3'
外切活性，现在已经取代了KlenowDNA聚合酶的这一作用。
③通过置换反应对DNA进行末端标记。
但是该作用也已经被T4或T7DNA聚合酶代替；
它还可以在补平3'
凹端的过程中进行标记。
④在cDNA克隆中合成第二链。
⑤随机引物标记。
⑥应用于Sanger双脱氧链末端终止法的DNA测序（已经被T7DNA聚合酶取代）。
⑦应用于PCR反应，现在已经被TaqDNA聚合酶等取代。
⑧在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA。
2、什么是“星星活性”？
请简述酶切时如何避免产生星星活性”现象。
（8分）（staractivity）在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星号活性。
引起星星活性的因素有甘油浓度高（>
5%），酶过量（>
100U/l），离子强度低（<
25mM），pH值过高（>
8.0），或是加了有机溶剂如PMSD（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、sulphalane等等，或是用其它二价阳离子如Mn++、Cu++、Co++或Zn++代替了Mg++。
但不同的酶对上述条件的敏感性不一样，如PstⅠ比EcoRⅠ对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感。
抑制星星活性的措施有许多，如减少酶的用量（可避免过份酶切），减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到100～150mM（如果不会抑制酶的活性的话），降低反应pH至pH7.0，以及保证使用Mg++作为二价阳离子。
3.PCR技术的工作原理是什么
？
用T－载体克隆PCR产物的原理是什么。
经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因
•它包括三个基本步骤:
•
（1）变性（Denature）:
目的双链DNA片段在94℃下解链;
•
（2）退火（Anneal）:
两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对;
•（3）延伸（Extension）:
在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.
•由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍
TaqDNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可在DNA片段的3'
末端添加一个核苷酸，通常为A。
因此，TaqDNA聚合酶扩增的产物可与T-载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的。
T-载体最初由Promega公司开发出商品，并一直沿用到现在，如和pGEM-TEasy（图5-2）。
这些载体特点是，将普通的克隆载体切成线状，并使之在3'
末端含有一个凸出碱基T。
pGEM-T是在pGEM-5Zf（+）基础上改造而来的，即在其多克隆位点中的EcoRⅤ处将载体切成平末端的线状DNA，再在其3'
末端添加一个T碱基。
在DNA的3'
末端添加一个T碱基的方法有很多，如用末端转移酶和底物ddTMP可以产生单个T的突出末端；
有些识别不对称序列的限制性内切酶，如MboⅡ、XcmⅠ和HphⅠ，在切割DNA后可直接产生一个3'
突出的T；
用TaqDNA聚合酶和高浓度的dTTP也可产生3'
突出的T。
4.请简述在进行RNA操作时该如何避免mRNA降解。
由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。
所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。
所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。
凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理,再用蒸馏水冲净。
DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。
DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。
试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。
但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。
配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。
除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。
此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。
5.请简述基因的结构对基因操作的影响。
（5分）（这一题下面答案写的有点怪，大家自己参照课本第10、11页）
基因组序列：
内含子，外显子
mRNA/cDNA：
G帽子polyA，UTR，ORF，
6．请简述碱裂解法从大肠杆菌中提取质粒的原理。
质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:
培养细菌使质粒扩增；
收集和裂解细胞;
分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA（CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
7．哪些分子生物学的工具酶可用于DNA片断的末端标记？
（5分）
Klenow片段DNA聚合酶ⅠT4DNA聚合酶T7DNA聚合酶同多核苷酸激酶
8．基因克隆的基本载体应具备哪些元件？
将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。
基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制
（2）有选择性标记（3）有一段多克隆位点外源DNA插入其中不影响载体的复制（4）分子量小，拷贝数多（5）容易从宿主细胞中分离纯化
三、论述题（10分）
典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？
（1）目的基因的获得:
⏹①从细胞中提取DNA；
⏹②利用限制酶制备具有粘性末端或平端的
目的DNA片断;
⏹③用机械方法剪切,如用超声波断裂DNA;
⏹④经反转录酶制备cDNA,如胰岛素基因;
⏹⑤用PCR拉出目的基因;
⏹⑥根据肽链顺序用DNA合成仪人工合成目
的基因.
（2）体外重组
①黏性末端连接,如E.coRIGAATTC
②平端连接,如HpaIGTTAAC和机械
方法剪切,用连接酶连接;
③同聚末端连接,用脱氧核苷酸转移酶（末端移酶）可在3`端合成低聚多核苷酸,如poly（T）和poly（A）,分别接在载体和目的基因上,先形成氢键,再用连接酶连接.
④用人工接头分子连接.如人工合成的寡聚核苷酸接头,限制酶识别位点等
（3）重组体导入宿主
①转化（transformation）:
适合质粒（plasmid）作载体;
②转染（transfection）:
适合噬菌体作载体;
③转导（transduction）:
④脂质体-介导（liposome-mediated）基因转移;
⑤微注射（microinjection）:
适合真核细胞;
⑥电穿孔（electroporation）法:
⑦基因枪（biolistics,genegun）:
适合植物细胞;
（4）重组体克隆的筛选与鉴定
①筛选阳性菌落或噬菌斑
a.利用载体的遗传标记,如抗性;
b.lac-Z显色反应遗传互补
c.DNA琼脂糖电泳
②鉴定重组体
a.菌落或噬菌斑原位分子杂交;
b.测序;
b.免疫化学和其它产物分析方法.
（5）外源基因表达产物的分离提纯
①电泳
②过柱
a.葡聚糖
b.亲和层析柱
③液相色谱
五.综合题（5分）
认真阅读后，请回答（可用英文作答）：
（1）在94℃下，DNA以何种形态存在？
（1分）
（2）退火时，在什么情况下单链的引物和单链的模板之间的氢键才不能断裂（2分）？
（3）72℃延伸时，DNA聚合酶是以何方向阅读模板链的？
DNA聚合酶在引物的哪一端加dNTP？
（2分）
ThecyclingreactionsofPCR（PolymeraseChainReaction）
1.Denaturationat94℃:
Duringthedenaturation,thedoublestrandmeltsopentosinglestrandedDNA,allenzymaticreactionsstop（forexample:
theextensionfromapreviouscycle）.
2.Annealingat54℃:
Theprimersarejigglingaround,causedbytheBrownianmotion.Hydrogenbondsareconstantlyformedandbrokenbetweenthesinglestrandedprimerandthesinglestrandedtemplate.Themorestablebondslastalittlebitlonger（primersthatfitexactly）andonthatlittlepieceofdoublestrandedDNA（templateandprimer）,thepolymerasecanattachandstartscopyingthetemplate.Oncethereareafewbasesbuiltin,thehydrogenbondissostrongbetweenthetemplateandtheprimer,thatitdoesnotbreakanymore.
3.extensionat72℃:
Thisistheidealworkingtemperatureforthepolymerase.Theprimers,wherethereareafewbasesbuiltin,haveastrongerattractiontothetemplate,createdbyhydrogenbonds,thantheforcesbreakingtheseattractions.Primersthatareonpositionswithnoexactmatch,getlooseagain（becauseofthehighertemperature）anddon'
tgiveanextensionofthefragment.
Thebases（complementarytothetemplate）arecoupledtotheprimeronthe3'
side（thepolymeraseaddsdNTP'
sfrom5'
to3'
readingthetemplatefrom3'
to5'
side,basesareaddedcomplementarytothetemplate）
答：
thedoublestrandmeltsopentosinglestrandedDNA,
Oncethereareafewbasesbuiltin,thehydrogenbondissostrongbetweenthetemplateandtheprimer,thatitdoesnotbreakanymore.
thepolymeraseaddsdNTP'
side,basesareaddedcomplementarytothetemplat.
试卷二
一、写出下列英文缩写字母所代表的中文含义（15分，每题0.5分）
1.PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.
2.TAE含EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸
2.的电泳缓冲液
3.EDTA二乙胺四乙酸
4.TBETris-硼酸和EDTA的电泳缓冲液
5.TPETris-磷酸和EDTA
6.ddNTP2`,3`－双脱氧核苷三磷酸
7.cDNA互补DNA
8.dsDNA双链DNA
9.EPO促红细胞生成素
10.HAS血清蛋白素
11.TPA组织纤溶酶原激活剂
12.RFDNA复制型DNA
13.phagemid噬菌粒
14.YAC酵母人工染色体
15.BAC细菌人工染色体载体
16.ampr氨苄青霉素抗性基因
17.MSC多克隆位点
18.BAP细菌的碱性磷酸酶
19.CIP牛小肠碱性磷酸酶
20.TdT末端转移酶
21.lacZβ-半乳糖苷酶基因
22.AD转录激活结构域
23.DBDDNA结合结构域
24.ori复制起点
25.PCR聚合酶链式反应
26.BSA小牛血请白蛋白
27.RNaseA核糖核酸酶A
28.DNaseⅠ脱氧核糖核酸酶Ⅰ
29.ESC胚胎干细胞
30.GST谷胱甘肽－S－转移酶
二、术语解释20分
1.转基因动物：
转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。
2.基因文库：
指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。
3.穿梭载体（Shuttlevector）：
是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。
4.生物芯片（Biochip）:
是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。
5.随机引物：
能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片断叫随机引物。
6.探针：
用作检测的核酸片段即为探针（probe）。
探针必须经过标记，以便示踪和检测。
7.同尾酶：
许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。
这些酶统称为同尾酶。
8.粘性末端：
识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。
9.基因工程（geneticengineering）:
就是在分子水平上，在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），然后转入微生物、植物或动物细胞内，使外源DNA（基因）在收体细胞中进行复制和表达，按照人们的需要生产不同的产物或者定向地创造生物的新性状，并能稳定的遗传给下代。
10.星号活性（staractivity）:
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星号活性。
三、简答题（40分）
1.简述琼脂糖凝胶电泳
分离鉴定和纯化DNA片段的原理以及影响DNA片段迁移速率的因素。
•DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。
分子筛效应。
•琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。
在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
•1、DNA的分子大小:
•线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
•2、琼脂糖浓度
•一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
•3、DNA分子的构象
•当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
•4、电源电压
•在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
•5、嵌入染料的存在。
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
•6、离子强度影响
•电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。
在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶）,电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中（如误加10×
电泳缓冲液）,则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
2、简述PCR技术的原理和基本步骤。
（6分）
3.什么叫PCR扩增
引物？
简述PCR
引物设计时需要遵循的原则。
•引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
•
（1）引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。
太长则比较浪费,且难以合成。
•
（2）引物中G+C含量尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均
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