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绝大多数脂肪酶的活性中心都是由Ser和His参与组成（BaleaoVM,1996）Ser、His与另一种氨基酸残基（如CCl和GCL的GLU,RML和hPL的Asp）一起构成脂肪酶催化中心的三元组。

如下图（VanTH,1993）。

BaleaoVM等（1996）报道的人胰脂肪酶（HPL）,BradyL等（1990）报道的Rhizomcormiehei脂肪酶（RML）和SchragJD等（1991）报道的Geocandidum脂肪酶等的蛋白晶体结构已经研究清楚。

Geocandidum的立体结构也证明这种三联体的存在，见图1（BradyLetal,1990）。

上述三种脂肪酶中，活性中心丝氨酸残基的侧链构象在空间结构方面与丝氨酸蛋白酶的非常相似，不同的是脂肪酶的活性中心隐藏在蛋白质内部。

2.1.2脂肪酶的作用机理

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；

Schmid）。

脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。

脂肪酶的催化特性在于：

在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv就发现了这一现象。

溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。

这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。

酯酶（EC3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。

酶的底物特异性与其结构和酶的活性中心有关。

不同微生物来源的脂肪酶其组成成分、理化特性各不相同。

主要可分为三大类：

脂肪酸专一性、酯键位置专一性和立体专一性。

脂肪酸专一性：

脂肪酶对不同碳链长度的脂肪酸表现出特殊反应性。

不同来源的脂肪酶水解油脂的脂肪酸专一性有很大的差异。

例如圆弧青霉和B.Subtilis（LesuisseE,1993）脂肪酶对短链（C8以下）脂肪酶，黑曲霉和根霉产生的脂肪酸对中等链长（C8~C12）脂肪酸具有特异性（曹淑桂，1995），而白地霉（李香春，20**;

JensenRG,1974;

岩井美枝子，1989）和P.alcoligenes（LentinghBM,1993）产生的脂肪酶对三油酸（不饱和脂肪酸）呈现强特异性。

酯键位置专一性：

指脂肪酶对底物甘油三酯中的1,3位或2位酯键的识别。

三酸甘油酯具有三个酯键，根据脂肪酶对底物作用位置不同可将其分为无位置特异性脂肪酶和位置特异性脂肪酶。

例如，黑曲霉、根霉、铜绿假单胞菌（GilbertEJ,1991）、P.alcoligenes的脂肪酶仅催化1或3位酯键水解，对2位酯键无作用；

白地霉、圆弧青霉、伯克霍尔德氏菌和荧光假单胞菌的脂肪酶无位置特异性（曹淑桂，20**），水解甘油三酯的所有酯键；

目前仅发现一种可水解2位酯键的脂肪酶来源于Geotrichumsp.（AsaharaTetal.1993）。

立体专一性：

指脂肪酶对底物甘油三酯中立体对映结构的1位和3位酯键的识别和选择水解。

不少脂肪酶催化拆分外消旋化合物的反应具较高的立体选择性（E>

90）,例如，Akesson等发现，来源于荧光假单胞菌脂肪酶能区分Sn-1和Sn-3位二酰基甘油，但水解Sn-2、Sn-3二酰基甘油比水解它的对应体速度快得多。

因此这类脂肪酸被广泛应用到医药领域（宋欣，20**）。

2.2产脂肪酶的微生物

最早报道的是兔胰脂肪酶，后来在植物种子中也发现了脂肪酶，而微生物是20世纪初发现的。

微生物脂肪酶种类多，且较动植物更易获得纯培养，制备周期短，便于工业化生产和获得高纯度的酶制剂，使得微生物脂肪酶在酶理论研究及实际应用中的重要性逐渐增加，因此对其研究和应用上的发展相当迅速。

目前商业脂肪酶绝大多数都是微生物脂肪酶。

2.3产脂肪酶菌的筛选方法

筛选脂肪酶高产菌的方法常见的是采用含甘油三酯琼脂平板。

首先采集含油污土壤样品或其它杂物如油垢、费油布等，无菌水梯度稀释样品，涂平板，培养，观察平板上菌落周围透明圈或通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维多利亚蓝等作为筛选标记，观察变色圈的大小。

透明圈和变色圈的有无与大小说明菌株产脂肪酶能力，即透明圈和变色圈越大，菌株产脂肪酶能力越大。

2.4脂肪酶的活性测定

脂肪酶的活力测定分两大类，定性检测和定量检测[4]。

一般根据目的的不同选择合适的底物和方法。

定性检测脂肪酶活力主要采用平板法，即在含有底物的平板上打孔，将酶液加入到孔内，然后根据水解定性分析脂肪酶活力高低。

如kouker等于1987年报道了一种脂肪酶平板检测法，他们以三油酸甘油为底物，罗丹明B为指示剂，在平板上比较酶液周围荧光圈大小，进而判断脂肪酶活力大小。

常用的定量测定方法有三种：

碱滴定法、PNPB法、皂铜法。

2.4.1碱滴定法

这是最早也是使用最为普遍的用于脂肪酶活性检测的方法。

原理为以橄榄油或三油酸甘油酯或三丁酸甘油酯和2%聚乙烯醇乳化液为底物，在脂肪酶作用下，脂肪酶水解为甘油及游离脂肪酸，以1%酚酞为指示剂，用0.05MNaOH中和反应产生的脂肪酸，每产生1umol脂肪酸定义为一个酶活力单位。

三种方法中碱滴定法（FoxPF1983;

YeapCK,1998;

HeeBZ,20**）最为常用，该法简单易行。

不过使用碱滴定法时如何选择底物是关键之一，其中，三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯为国外进口的商品，脂肪酶活力检测的结果稳定性优于国产的橄榄油。

2.4.2PNPB法

PNPB（LeeDWetal.1999）法因其反应灵敏、重复性较好，是目前国外普遍采用的测活方法。

此法不同于碱滴定法，它的原理为在一定的PH/温度条件下，以对硝基苯丁酸酯为底物，乙腈为溶剂，加入酶液反应15分钟，然后在405nm下测定反应产生的对硝基苯的吸光度，以反应产生的对硝基苯的量评估酶活力，测定前需制作对硝基苯吸光度标准曲线。

该法活力单位定义为：

脂肪酶在最是温度、最适PH下，每分钟水解产生1umol的对硝基苯酚所需的酶量。

该法的缺点是底物价格昂贵。

2.4.3皂铜法

是以甘油三酯和阿拉伯胶为底物，反应产生的脂肪酸用有机溶剂（正己烷）抽提，然后有机相中加入醋酸铜水溶液生成皂铜，最后提取有机相，加入染色剂二乙基二硫氨基甲酸，混合均匀后在430nm测定二乙基二硫氨基甲酸的吸光度，反应也需制作吸光度标准曲线。

该法检测灵敏度高，但是由于试验中使用大量苯进行铜皂的萃取，容易造成环境污染和对人体的伤害。

因此，PNPB法和皂铜法（LeeDWetal.1999）虽然检测灵敏度高，但相对操作繁琐，而且PNPB法使用的试剂昂贵。

因此，建议酶量和总酶活较高时，可以用碱滴定法，而当脂肪酶经过凝胶过滤、离子交换层析后总酶活较低，可以用PNPB法和皂铜法。

此外，尚有一些其他测定方法，如在Beisson等报道了甘油氧化法、PH电极自动滴定法、油膜表面张力法等，因不常用，不做详细介绍。

2.5脂肪酶活性的影响因素

脂肪酶活性的影响因子很多，包括各种金属离子和有机化合物及表面活性剂等物质。

王艳茹（1999）报道了Ca2+和K+对一株微球菌所产脂肪酶有激活作用，而Cu2+、Mn2+、Fe2+等对酶有抑制作用。

吴松刚等（1997）报道了Ca2+和Mg2+对一株细菌有较强的激活作用，Na+、K+和Li+具有微弱激活作用，而Pb+、Ca2+和Co2+则表现为不同程度的抑制作用。

牛冬云等（20**）报道了微量（<

0.01mol/L）的Ca2+和K+对一株解淀粉芽孢杆菌有激活作用，过量时有抑制作用。

Chartrain等发现1mMZn2+可以抑制P.aeruginosaMB5001脂肪酶94%的酶活力，而加入10mMCa2+可重新将酶激活。

P.pseudoalcaligenesF-111脂肪酶能够在30℃1mMFe3+中保温1h被抑制60%的酶活，但1mMCa2+、Hg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Co2+、Cd2+、Pb+等在同一条件下对酶活没有显著性影响。

邹文欣等（1996）报道了Ca2+、Mn2+和Ba2+对液化沙雷氏菌脂肪酶有一定激活作用，Mg2+、Na+、K+对酶活性的影响不大，Fe2+和Fe3+抑制酶活，Zn2+则使酶活性完全丧失，Ca2+能和脂肪酸生成不溶的丐皂而促进反应的进行，也有人推测Ca2+是脂肪酶的一个组成成分。

另外，某些有机化合物及表面活性剂对酶活性的影响也较大，有的活性剂可以增加酶活，HouriaAbbas等的实验分别测定了加入0.005%的Tween20和Tween80可以使StrainDB700A的脂肪酶活性增加一倍多，但若按1%的量加入去污剂，酶活则略有降低；

加入10mmol/L胆酸盐能明显提高酶的活性，而SDS、TritonX-100等能明显抑制其活性，该酶在乙醇中很快失活，而在丙酮中5天后还有89%活性。

第三章实验部分

3.1材料、试剂及仪器

3.1.1材料

从学院餐厅附近油污桶壁上采集的土样。

3.1.2试剂

表1.1常用生化试剂

药品名称

生产公司

橄榄油

莱阳鲁花浓香花生油有限公司

酵母浸膏

北京双旋微生物培养基制品厂

磷酸氢二钾

原新光化学试剂厂

磷酸二氢钾

北京益利精细化学品有限公司

氯化钠

天津市北方天医化学试剂厂

七水硫酸镁

北京化工厂

硫酸铵

天津石钟厂霸州市化工分厂

磷酸二氢钠

天津市博迪化工有限公司

氯化钙

氢氧化钠

西陇化工股份有限公司

蔗糖

天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司

聚乙烯醇

邻苯二甲酸氢钾

95%乙醇

天津市永大化学试剂有限公司

溴甲酚紫

北京化学试剂公司

罗丹明B

配制试剂

1）溴甲酚紫

变色范围：

PH5.2~6.8，颜色由黄变紫。

常用浓度为0.04%[5]。

配制：

称0.1g指示剂，加18.5mL0.01mol/LNaOH，加蒸馏水至250mL.

2）2%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）溶液

称取20g聚乙烯醇（PVA）放入80mL蒸馏水中，边搅拌边加热，使其完全溶解，自然冷却后加蒸馏水定容至100mL。

用双层纱布过滤，保存滤液备用。

3）橄榄油乳化液

取橄榄油和聚乙烯醇按1：

3比例混合，用高速组织搅拌机搅拌乳化3~5分钟，4℃备用。

4）0.025mol/LPH7.5磷酸缓冲液

甲液：

称取化学纯KH2PO417.01g，加蒸馏水溶解定容至500mL.

乙液：

称取化学纯Na2HPO444.77g,加蒸馏水溶解定容至500mL.

吸取甲液13mL，加入乙液100mL，即成0.025mol/LPH7.5磷酸缓冲液。

以酸度计或精密试纸校正PH。

使用时用蒸馏水稀释10倍，即成0.025mol/LPH7.5磷酸缓冲液。

5）0.05mol/LNaOH溶液

称取分析纯NaOH4.5g，用蒸馏水溶解定容至1000mL（约0.1mol/L），用邻苯二甲酸氢钾标定。

然后再用蒸馏水稀释一倍，即为0.05mol/LNaOH溶液，此液贮于附有钠石灰管的玻璃瓶中使用。

标定：

精确称取105℃干燥至恒重邻苯二甲酸氢钾0.5000克置250mL锥形瓶中，加50mL煮沸后冷却的蒸馏水溶解，再加2滴1%酚酞指示剂（以95%中性酒精配制）以待标定的0.1mol/LNaOH滴定至微红色为终点。

N=W/（V×

0.2042）

式中，N—NaOH溶液的摩尔浓度

W—邻苯二甲酸氢钾的克数

V—滴定消耗NaOH溶液的毫升数

0.2042—邻苯二甲酸氢钾的毫克摩尔

3.1.3主要仪器设备

表1.2使用的仪器设备

仪器名称

电热恒温培养箱

上海精宏实验设备有限公司

电热恒温鼓风干燥箱

净化工作台

苏州净化设备有限公司

气浴恒温振荡器

金坛市大地自动化仪器厂

电子天平

海特勒-托利多仪器（上海）有限公司

立式压力蒸汽灭菌锅

江阴滨江医疗设备厂

容声牌电冰箱

生物显微镜

重庆光电仪器有限公司

3.1.4培养基的配制

1）富集培养基（%）

（NH4）2SO40.1，NH4NO30.1，NaCl0.1，MgSO4·

7H2O0.05，K2HPO40.1，橄榄油1.0，pH值为7.0。

在0.056MP高压蒸汽灭菌30min[7]。

2）分离培养基（%）

7H2O0.05，K2HPO40.1，琼脂1.5，橄榄油乳化液12.0，1.6%溴甲酚紫0.1，pH值为7.0。

3）初筛培养基（%）

7H2O0.05，K2HPO40.1，琼脂1.5，橄榄油乳化液12.0，1.6%溴甲酚紫0.1或者0.05%罗丹明B[10]2.0，pH值为7.0。

在0.056MP高压蒸汽灭菌30min。

4）种子斜面培养基（%）

NaNO30.2，MgSO4·

7H2O0.05，K2HPO40.1，KCl0.05，FeSO4·

7H2O0.001，蔗糖3.0，琼脂2.5，pH值为7.0。

5）发酵培养基（%）

（NH4）2SO40.1，MgSO4·

7H2O0.1，K2HPO40.1，蔗糖0.5，橄榄油0.5，蛋白胨3.0，pH值自然

3.2产脂肪酶菌株的筛选

3.2.1富集培养

采集的土样称取5g溶于45mL无菌生理盐水（带玻璃珠）作1∶10稀释，充分摇匀，静止，取稀释液5mL加入到装有50mL富集培养基的三角瓶中，在摇床上30℃，180r/min，振荡培养5d。

3.2.2平板分离

从产生混浊的富集培养液取样，作梯度稀释（10-2~10-7），即取富集样液1mL加入到9mL无菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，制成浓度为10-2的稀释液，再从中吸取1mL加入到另一支9mL无菌生理盐水的试管中制成浓度为10-3的稀释液，以此类推梯度稀释到10-7，各取0.1mL涂布于分离平板，倒置，于30℃培养3d~5d，如果菌落周围形成黄色透明圈（脂肪酸与溴甲酚紫反应形成黄色透明圈），则表明该菌株能分解利用培养基中的油脂。

3.2.3产脂肪酶菌株的初筛

将分离平板上的产酶菌落编号，接种到种子斜面培养基上，并同时分别转入含溴甲酚紫和含罗丹明B的初筛培养基平板上，30℃倒置培养，用游标卡尺测量菌落直径和变色圈直径，以变色圈直径与菌落直径的比值作为初筛依据，选出高酶活菌株。

3.2.4产脂肪酶菌株的复筛

将初筛确定的高酶活菌株，从斜面培养基取菌，接入装有50mL产脂肪酶发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃振荡培养3d。

将培养液用漏斗加滤纸过滤，取清液检测脂肪酶活力。

3.2.5脂肪酶产生菌的保藏方法

方法一：

取2ml灭过菌的离心管，加入约1~2ml无菌蒸馏水；

取分离到的已经活化的脂肪酶产生菌，刮取菌体于上述的离心管内，分别编号，于4℃下保藏。

以上操作都在无菌条件下完成。

方法二：

斜面保藏，取2ml灭过菌的离心管，加入1ml左右的油脂培养基，摆成斜面，待培养基冷却后，将生长旺盛的菌株接种到斜面，待其生长一定时间后，置于4℃下保藏，定期检查。

3.2.6脂肪酶活性的测定

脂肪酶从橄榄油中分解出脂肪酸，这些脂肪酸又被过量添加的NaOH中和，然后用HCl回滴，可以测定出脂肪酸的量。

在规定条件下，每分钟释放出1μmol游离脂肪酸所需的酶量定义为1个脂肪酶活力单位（U）。

反应乳化液的配制：

取5.0gPVA,加入100ml水，加热溶解，冷却后用2mol/LNaOH调至7.8，过滤，定容为100ml，加入橄榄油，两者比例为4:

1，在摇床上振荡乳化至乳白色。

0.1mol/LTris-HCL缓冲液的制备：

称取，加入12.144gTris-B，用1L水溶解，用1mol/LHCL调pH8.0,备用，需新鲜配制。

0.05mol/LNaOH溶液的制备：

取4.58g固体NaOH溶于1L水中，用邻苯二甲酸氢钾标定，使用时稀释1倍。

1%酚酞做指示剂，95%乙醇作反应终止剂

橄榄油乳化液4mL，0.1mol/LTris-HCL缓冲液4mL，稀释的待测酶液2mL。

取100ml三角瓶2只，分别加入上述反应液，37℃水浴反应20min后加待测酶液前需预热5min左右），加入10mL95%乙醇终止反应。

取出，于空白和样品中各加入2滴酚酞做指示剂，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为终点。

记录消耗的NaOH体积，对照组的乙醇终止剂应在加入酶液之前加入。

酶活计算：

U=（V-V0）×

50×

n/t

式中：

U—样品的酶活力；

V—滴定样品时消耗0.05mol/LNaOH标准溶液的体积；

V0—滴定对照时消耗0.05mol/LNaOH标准溶液的体积；

50—0.05mol/LNaOH标准溶液1.00ml相当于50umol脂肪酸；

n—酶液体积

t—反应时间/min

第四章结果与讨论

4.1结果

4.1.1产生脂肪酶菌株的菌落形态鉴定

菌株在溴甲酚紫的培养基上30℃培养5d的菌落呈乳白色，不透明，表面光滑隆起，湿润，边缘不整齐，周围的水解圈呈黄色，且透明。

菌株在罗丹明B初筛培养基上30℃培养2d后呈深粉色，不透明，表面光滑，隆起，湿润，边缘整齐极尽圆形，周围水解圈呈白粉色且不透明[9]。

4.1.2产生脂肪酶菌株的筛选

经过筛选得到了25株产脂肪酶的细菌菌株，用游标卡尺测量出其直径以及水解圈大小，并计算出水解圈与菌株直径大小比值，其比值范围在1.97~4.87之间（表1）。

菌株编号为01~08号、09号、10~15号、16~21号、22~25号分别是由10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度产生。

大小形态以及比值相差不大并集中居多的在10-4浓度处。

4.1.3产脂肪酶高酶活菌株酶活力测定

由表2可知，筛选出来的菌株脂肪酶的活性与水解圈和菌株大小的比值呈一定的线性关系：

脂肪酶的活力随着水解圈与菌株大小的比值的变化而变化。

4.2讨论

4.2.1脂肪酶产生菌的筛选

菌种筛选是一项工作量较大的工作，要快速、高效的分离到有用的菌株，必需建立一套有效的筛选方法模型[8]。

本实验采用的分离方法是溴甲酚紫显色法，此方法是利用了脂肪酶水解脂肪产酸导致生长环境PH值下降，显示指示剂的存在可以使细菌周围形成显色圈，根据水解圈直径与细菌菌落直径之比大小作为初筛依据。

本实验用于筛选的指示剂是溴甲酚紫，筛选效果不太理想，对于产酶能力强的菌株，显色效果明显，而由于溴甲酚紫的变色范围位4.0~6.8比较狭窄，导致有些产酶能力不强，但对于生长环境偏碱性的弱脂肪酶菌则显色效果差。

甚至不显色。

另外利用酸碱显色反应的原理筛选的过程中，有可能存在其他因素使培养基中出现酸而不是酶水解产酸而出现的酸碱显色反应，例如，有些微生物本身能够产酸。

这样根据变色圈来分离产脂肪酶的微生物的误差有点大。

现在脂肪酶分离筛选使用的底物很多，包括三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、橄榄油等。

三丁酸甘油酯作底物时因其链长太短，且价格昂贵而被放弃；

橄榄油被很多研究者作为底物来分离脂肪酶菌。

4.2.2菌株的鉴定

菌株在罗丹明B初筛培养基上30℃培养2d后呈深粉色，不透明，表面光滑，隆起，湿润，边缘整齐极尽圆形，周围水解圈呈白粉色