不同氨基酸对雷公藤不定根生长及次生代谢产物含量的影响Word格式文档下载.docx

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　　雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.为卫矛科雷公藤属多年生木质藤本植物，在我国主要分布于长江流域以南各地及西南地区。

其根部所含的次生代谢产物雷公藤内酯醇（雷公藤甲素），具有抗炎、抗类风湿、抗肿瘤、抗HIV及治疗老年性痴呆症等功效，临床上常用于治疗红斑狼疮，慢性肾炎，皮肤病，白血病以及多种自身免疫性疾病[1-4]，作为生物农药，雷公藤内酯醇具有触杀、胃毒、拒食等作用[5-6]。

雷公藤生物碱具有杀虫谱广、作用方式多样、杀虫效果较好等优点[9-10]。

其中，雷公藤次碱、雷公藤春碱等具有明现的体液免疫抑制作用[8]。

然而雷公藤自然生长较慢，多年来大量采挖，造成野生资源稀少，无法满足市场需求[10-11]，寻求其他方法来解决这一问题越加紧迫。

通过前期试验发现，雷公藤悬浮细胞培养所含的次生代谢产物含量较低，相比较悬浮细胞不定根具有生长速度快、次生代谢产物含量高，并且雷公藤内酯醇和雷公藤生物碱均为分泌型成分，培养不定根后每瓶培养液中雷公藤内酯醇和雷公藤生物碱的含量远远超过了不定根中的含量等优点[12-14]。

雷公藤生物碱主要是倍半萜吡啶生物碱，由倍半萜和生物碱通过酯化反应生成，Liao认为倍半萜吡啶生物碱中吡啶部分和倍半萜部分生物合成途径中，天冬氨酸，异亮氨酸，烟酸等参与了吡啶部分的生物合成[15]。

为了提高雷公藤不定根中雷公藤内酯醇，雷公藤生物碱等主要次生代谢产物的含量，本试验研究了不同培养时间添加不同浓度的氨基酸，对雷公藤不定根的生长以及次生代谢产物含量的影响。

　　1材料

　　雷公藤不定根为本实验室经过多代继代培养保存的材料。

　　高效液相色谱仪（Waters600E，Milford，USA）、Waters2478紫外检测器。

雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱对照品由上海同田生物技术有限公司提供。

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

　　2方法

　　分别将天冬氨酸，异亮氨酸，半胱氨酸，精氨酸溶解于无菌水，配成1.0mmol?

L-1的母液，调节其pH至5.8，并在超净工作台中用0.22μm滤膜过滤除菌。

继代培养的雷公藤不定根生长至第1周，第2周，第3周时，在培养基中分别添加0.05，0.25，0.50，1.00mmol?

L-1的4种氨基酸，每个浓度至少3个重复。

培养至第30天收获不定根及培养液。

用适量去离子水将不定根上残留培养基冲洗干净，于60℃烘箱干燥至恒重，计算不定根增长量（收获量-接种量），粉碎过100目筛，保存于4℃冰箱供雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱含量的测定。

　　以上培养基均为MS+4.0mg?

L-1NAA+0.5mg?

L-1KT，加入蔗糖30g?

L-1，250mL三角瓶内装100mL培养基，接种密度为15～20g?

L-1，pH用PHS-2C型酸度计于高压灭菌前调至5.8～6.0，培养条件为温度（25±

1）℃，自然光照，摇床转速为120r?

min-1。

　　雷公藤不定根及培养液中雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的提取及含量测定参照文献[13]的方法。

　　采用SPSS软件对（Version16.0）对试验所得数据进行NAOVA方差分析，采用Duncan′s新复极差法检验数据之间的差异显著性。

　　3结果与分析

　　3.1天冬氨酸对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响

　　3.1.1天冬氨酸对雷公藤不定根生长和不定根中次生代谢产物含量的影响试验结果表明（图1），供试浓度范围内的天冬氨酸对不定根生长有明显的抑制作用，添加时间越早抑制作用越强，第1周添加0.5mmol?

L-1天冬氨酸后其生长量仅为对照的26.6%，第3周添加0.5mmol?

L-1天冬氨酸后其生长量为对照的92.2%，可能是在第3周不定根生长相对稳定，对天冬氨酸的耐受力增强。

虽然不同浓度天门冬氨酸处理对雷公藤内酯醇的含量均有明显的提高，但在第3周添加浓度0.25mmol?

L-1天冬氨酸时，不定根中的雷公藤内酯醇含量最高，为对照的1.36倍（图2），雷公藤吉碱含量为对照的1.16倍（图3）。

但雷公藤次碱的含量是在第2周添加0.25mmol?

L-1的天冬氨酸时最高，为对照的1.25倍。

　　3.1.2天冬氨酸对雷公藤不定根培养液中次生代谢产物含量的影响雷公藤内酯醇和雷公藤吉碱、雷公藤次碱等次生代谢产物均为分泌型化合物，不仅在雷公藤不定根中含量较高，在培养不定根的培养液中含量也比较高（图4）。

在第3周添加浓度为0.25mmol?

L-1的天冬氨酸时，培养液中的雷公藤内酯醇含量为对照的1.3倍，雷公藤吉碱为对照的1.37倍，在第3周培养液中雷公藤次碱的含量均有不同程度的提高，其中添加浓度为1.00mmol?

L-1天冬氨酸时雷公藤次碱的含量为对照的2.44倍。

但权衡不定根增长量、不定根中雷公藤内酯醇等代谢产物的含量等因素，在雷公藤不定根培养至第3周添加浓度为0.25mmol?

L-1的天冬氨酸能明显提高雷公藤内酯醇等次生代谢产物的含量。

　　3.2异亮氨酸对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响

　　3.2.1异亮氨酸对雷公藤不定根生长和不定根中次生代谢产物含量的影响异亮氨酸对雷公藤不定根生长和不定根中次生代谢产物含量的影响试验结果表明（图5），供试浓度范围内对不定根生长均有抑制作用，且添加时间越早、浓度越大，抑制作用越强。

0.05mmol?

L-1异亮氨酸，第1周添加时，增长量仅为对照的32.8%，第3周添加时增长量为对照的97.3%。

当异亮氨酸浓度低于0.25mmol?

L-1时对雷公藤不定根中内酯醇和吉碱的含量影响差异不显著，高浓度的异亮氨酸处理后，明显抑制不定根中内酯醇和吉碱的生成（图6，7）。

早期添加异亮氨酸不利于不定根中雷公藤次碱的形成，但第3周添加异亮氨酸浓度在0～0.5mmol?

L-1雷公藤次碱的含量随着浓度的升高而升高，当浓度为0.5mmol?

L-1时雷公藤次碱的含量为对照的1.79倍（图7）。

　　3.2.2异亮氨酸对雷公藤不定根培养液中次生代谢产物含量的影响不同浓度的异亮氨酸处理对雷公藤不定根培养液中雷公藤内酯醇的含量有抑制作用，随着异亮氨酸浓度增加抑制作用越强（图8）。

与对照相比第3周添加浓度为0.05mmol?

L-1异亮氨酸时培养液中雷公藤吉碱为对照的1.27倍，雷公藤次碱为对照的1.15倍。

　　3.3半胱氨酸对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响

　　3.3.1半胱氨酸对雷公藤不定根生长和不定根中次生代谢产物含量的影响半胱氨酸对雷公藤不定根的生长起明显的抑制作用，且浓度越大抑制作用越强，但随着不定根的生长添加的越晚抑制作用越弱，其中第3周添加0.05mmol?

L-1半胱氨酸其生长量为对照的99.3%（图9）。

虽然第1周添加0.25mmol?

L-1半胱氨酸时，不定根增长量仅为对照的77.5%，但不定根中雷公藤内酯醇含量为对照的1.87倍（图10）。

雷公藤吉碱含量在第2周添加0.50mmol?

L-1半胱氨酸时最高，为对照的1.17倍，但此时不定根增长量仅为对照的60%。

雷公藤次碱含量在第3周添加1.00mmol?

L-1半胱氨酸时最高，为对照的1.81倍（图11），但此时不定根增长量仅为对照的43.5%。

　　3.3.2半胱氨酸对雷公藤不定根培养液中次生代谢产物含量的影响不同浓度的半胱氨酸处理对雷公藤不定根培养液中雷公藤内酯醇的含量差异较大（图12），在第3周添加0.50mmol?

L-1半胱氨酸时，不定根培养液中的雷公藤内酯醇含量最高，为对照的1.28倍。

在第3周随着半胱氨酸添加浓度的增加，培养液中雷公藤吉碱的积累也逐渐增加，当半胱氨酸浓度为1.00mmol?

L-1时最高，为对照的1.79倍。

培养液中雷公藤次碱的积累也在第2，3周随着半胱氨酸添加浓度的增加而升高，其中第2周添加1.00mmol?

L-1半胱氨酸时，雷公藤次碱含量最高为对照的2.97倍。

　　3.4精氨酸对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响

　　3.4.1精氨酸对雷公藤不定根生长和不定根中次生代谢产物含量的影响在雷公藤不定根生长的早期添加精氨酸明显抑制其生长（图13），但在第3周添加不同浓度的精氨酸均能提高不定根的增长量，其中当精氨酸浓度为0.25mmol?

L-1时不定根增长量为对照的1.29倍。

在第2周添加不同浓度精氨酸时不定根中的雷公藤内酯醇含量随着添加浓度的升高而升高，当精氨酸浓度达1.00mmol?

L-1时雷公藤内酯醇含量为对照的1.9倍（图14）。

在第3周添加低浓度的精氨酸时，雷公藤吉碱和次碱的含量均随着精氨酸浓度的升高而升高，当精氨酸浓度为0.50mmol?

L-1时，雷公藤吉碱和次碱的含量达最大值，分别为对照的1.3，1.4倍（图15）。

　　3.4.2精氨酸对雷公藤不定根培养液中次生代谢产物含量的影响第1周添加不同浓度的精氨酸后，虽然不定根的增长量随着精氨酸浓度的增加而下降，但培养液中雷公藤内酯醇的含量随着精氨酸浓度的增加而上升，在第2周添加时，雷公藤内酯醇的含量随着精氨酸浓度的增加而下降，第3周添加精氨酸时，浓度过高也抑制培养液中雷公藤内酯醇的积累（图16）。

培养液中雷公藤吉碱的含量无论添加时间添加浓度如何改变几乎均低于对照，而雷公藤次碱的含量在不同时间添加不同浓度精氨酸时几乎均高于对照，其中第1周添加0.25mmol?

L-1精氨酸时雷公藤次碱含量最高，为对照的3.22倍。

　　4讨论

　　在通过组织培养生产次生代谢产物的过程中，加入诱导子、次生代谢产物合成的前体物质以及代谢过程的中间产物，均可以有效调控次生代谢途径，有效的提高目的产物的含量[16-18]，以达到组织培养过程中目标产物的人为调控，从而解决目标产物含量过低的问题。

氨基酸作为代谢过程的前体物质，在生物体中还具有生物抗氧化活性[19]。

试验结果表明，大多数氨基酸对次生代谢产物的合成具有明显的促进作用[20-21]。

杨英等[22]曾报道苯丙氨酸和络氨酸均能提高胀果甘草Glycyrrhizainflata细胞合成黄酮的能力，当酪氨酸添加质量浓度为5mg?

L-1时，甘草细胞中甘草黄酮产量为对照的1.43倍。

本试验结果表明，除适当浓度的精氨酸能提高雷公藤不定根的生长外，不同时间添加不同浓度的天冬氨酸，异亮氨酸，半胱氨酸对不定根的生长均有不同程度的抑制作用。

但这4种氨基酸均能不同程度的提高雷公藤不定根中雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量。

究其原因可能是不同氨基酸在雷公藤不定根内合成次生代谢产物时发挥的功能不同。

在组织培养中，半胱氨酸是一种常用的抗氧化剂，能有效抑制过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性，从而抑制褐变的发生[23-25]。

吕春茂等研究发现，半胱氨酸还可以促进烟草不定根的生长[26]。

本试验发现，半胱氨酸对雷公藤不定根的生长起明显的抑制作用，但第1周添加0.25mmol?

L-1半胱氨酸时，不定根中雷公藤内酯醇含量为对照的1.87倍。

　　精氨酸及其代谢产物在植物的生命过程中起着十分重要的作用[27]。

它不仅是植物体内主要的氮素贮藏物质[28]，也是N/C比最高的氨基酸之一。

精氨酸还是一氧化氮、多胺、肌酸、谷氨酸、γ氨基丁酸等物质的生物合成前体，而一氧化氮和多胺都是植物中重要的信使分子，参与植物的生长发育、抗逆性等生理生化过程[29]，Tang等[30]报道多胺还参与对细胞分裂的调节。

杨洪强等[31]报道，精氨酸能增加苹果新根的数量，促进根系的生长。

试验结果表明，培养基中添加适当浓度的精氨酸不仅促进雷公藤不定根的生长，对不定根中次生代谢产物的积累也有明显的促进作用。

在第2周添加1.00mmol?

L-1精氨酸时雷公藤内酯醇含量为对照的1.9倍。

在第3周添加0.50mmol?

L-1精氨酸时雷公藤吉碱和次碱的含量分别为对照的1.3，1.4倍。

在雷公藤不定根培养中，究竟是精氨酸在起作用还是在精氨酸作用下形成的一氧化氮、多胺、肌酸、谷氨酸等在起作用，有待于进一步研究。

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　　Effectsofaminoacidongrowthandsecondarymetabolitescontentsof

　　adventitiousrootsofTripterygiumwilfordii

　　WENPeng-fei1，2，LEIJia-min1，2，LIQun1，2，CUILei1，2，LIYan1，2*，ZHANGXing2

　　（1.CollegeofLifeScience，NorthwestA&

FUniversity，Yangling712100，China；

　　2.ResearchandDevelopmentCenterofBiorationalPesticideNorthwestA&

FUniversity/ShaanxiProvince

　　TechnologyandEngineeringCenterofBiopesticide，Yangling712100，China）

　　[Abstract]TheadventitiousrootofTripterygiumwilfordiiwasusedasexperimentmaterialtostudyeffectsofvariousconcentrationofasparticacid，isoleucine，cysteineandarginineinMSmediumonthegrowthandtriptolide，wilforgine，wilforinecontentsoftheadventitiousroots.Theresultsshowedthatcomparedwiththecontrol，supplementedwith0.25mmol?

L-1asparticacidat3rdweek，thegrowthoftheadventitiousrootsonlyaccountedfor80%，butthecontentoftriptolideoftheadventitiousrootsandthemediumwas1.36，1.