酶工程实验1文档格式.docx
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四、实验难点
采用盐析分离纯化技术制备酶类产品时如何保证酶活力的同时提高酶产品的得率。
五、实验方式、方法建议
1、集中式训练：
学生在老师的讲解和指导下按如下步骤操作训练；
2、启发和探索式：
老师提供木瓜蛋白酶的理化、生物学特性、相关分离纯化技术和工艺，让学生查阅资料，然后在下面生产工艺基础上进行一些工艺和操作参数的试验，比如在（NH4）2SO4分级分离后采用层析分离或透析，试验层析或透析操作参数和比较集中工艺的优劣，以培养学生灵活运用分离纯化技术的能力。
六、实验原辅材料和仪器设备
1．原辅材料
（1）木瓜乳汁的采集及采后处理
在清晨或中午下雨后，选择2.5～3月龄已充分长大的青木瓜，用锋利刀片在未成熟的青果表面纵割3～4条线，下刀深度在2mm深以内，环绕茎干装一倒伞型收集盘，接收流下的乳汁。
割后30～60s乳汁停止流出，把粘在果上的乳汁赶入收集盘。
用浸过硫酸钙或杀菌剂溶液的洁净布擦果，防切口感染。
（2）硅藻土和河沙：
硅藻土选用化学纯试剂，河沙经清洗、浮选、烘干后过60～80目筛。
（3）半胱氨酸、（NH4）2SO4和NaCl均选用化学纯试剂。
（4）酶稀释液：
半胱氨酸0.03mol/L（0.1537g）、EDTA.2Na0.00603mol/L（0.0935g），两者分开用适量蒸馏水溶解，再将EDTA.2Na溶液倒入半胱氨酸溶液中，使其溶解，调节至pH4.5，定容至25ml。
（5）酪蛋白溶液（底物）：
称磷酸氢二钠1.447g加蒸馏水约80ml，溶解后加入0.80g酪蛋白，水浴上加热搅拌溶解，待完全溶解后，冷至室温，调pH至7.0，定容至100ml，摇匀。
（6）TCA溶液（变性剂）：
称三氯醋酸（TCA）2.247g，乙酸钠1.824g，冰醋酸2g，定容至l00ml。
（7）酪氨酸标准液（50μg/ml）：
称105℃烘至恒重的酪氨酸5.0㎎，用0.1mol/LHCl定容至100ml。
2．主要仪器设备：
研钵、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅。
七、训练内容和步骤
1、木瓜蛋白酶的分离纯化（下午组数据）
（1）粗提：
木瓜乳汁（28g）、硅藻土（14g）和筛选过的砂子（21g）混匀，在室温下加50ml半胱氨酸溶液，（0.04mol/L，pH5.7），在研钵中充分磨匀，静置后倾出上清液，再用50ml半胱氨酸溶液重复研磨和洗提，然后用半胱氨酸溶液定容到166ml（粗体积），用布氏漏斗过滤。
以下几步尽量在冰浴上进行。
（2）除不溶物：
取50ml滤液于小烧杯中，在搅拌下慢慢加入1mol/LNa0H溶液调pH至9.0，用36个1.5ml离心管盛装，离心（4℃,8000rpm／min，10min），取上清液。
（3）（NH4）2SO4分级分离：
取38ml上清液于小烧杯中，加入9.23g（NH4）2SO4至40%饱和溶液（1L：
243g），静置2h。
离心（4℃,8000rpm／min，10min），弃上清液，用饱和（NH4）2SO4溶液洗沉淀一次，剩6管。
（4）NaCl分级沉淀：
加半胱氨酸溶液（0.02mol/L，pH7.0）至满管，慢慢加入0.12g固体NaCl，静置lh，离心（4℃,8000rpm/min，20min）弃上清液。
（5）结晶：
在沉淀中加半胱氨酸溶液（0.02mol/L，pH5.7）至满管，立即调pH至6.5，静置30min，置于4℃下过夜，在4℃下离心（8000rpm/min，25min），收集结晶。
（6）重结晶：
将上述结晶在室温下溶于少量蒸馏水（蛋白酶浓度约1%）。
在搅拌下慢慢加入饱和NaCl溶液（10ml／300ml蛋白溶液），当约75%的溶液加入后。
木瓜蛋白酶将开始结晶，置于4℃下过夜，收集结晶。
2、木瓜蛋白酶活性测定
（1）样品处理：
在盛装结晶（样重约0.01g）的1.5ml离心管中加入酶稀释液500ul，混匀盖严，将酶激活15min以上（激活时半胱氨酸的浓度要高于0.03mol/L，而且要当天配制，激活的酶最好在2h内测完）备用。
（2）木瓜酶活力测定：
将已激活的酶液置于37℃水浴保温10min,吸取预热37℃酪蛋白液500ul加入此管，在37℃反应10min,立即加入300ul，TCA摇匀；
另取已激活的样液500ul，加入300ulTCA，37℃保温10min后立即加入预热37℃酪蛋白液500ul，摇匀。
以后管为对照，测前管的OD275值，即A=1.581。
另取酪氨酸标准液，以蒸馏水作空白对照，测OD275值，即As=0.318。
As：
50ug/ml酪氨酸的光吸收值；
A：
1ml激活酶作用于底物所得产物的光吸收值；
50：
标准酪氨酸的微克数/毫升；
10：
反应时间（min）；
500：
酶第一次稀释倍数（定容体积）；
3:
激活时酶液的稀释倍数；
11：
测定时酶液的稀释倍数。
八、实验结果与讨论
1．实验经过结晶后得到的木瓜蛋白酶是白色至黄色结晶状的固体。
2．本实验由于刚开始提取液较少，还有操作的不规范，提取的产物大概只有0.01g.
3.测得的OD值A=1.581As=0.318.
4.样品的木瓜蛋白酶活力
（1.581*50*（500*3）*11）/（10*0.01）=13043250
5．在实验过程中，有些实验步骤出现较大误差，还有所测得值只是大概值，所以本实验的测得酶活力不够准确。
但是本实验的操作技术基本掌握和熟悉。
分析和讨论：
1、记录木瓜蛋白酶工艺、操作条件、各原辅材料和试剂用量。
（1）．在本实验中提取的木瓜的乳汁非常少，一个木瓜提取量非常微量，本实验大概提取了70多个木瓜。
这一步的提取对后一步实验有着很大的影响。
（2）影响木瓜蛋白酶酶量的原因：
1.提取液较少的原因
2．实验中，EP管和小烧杯的来回转移会导致酶的丢失
3由于在测吸光值是所运用的石英比色皿是坏损的，对实验会造成一定的影响。
2．实验注意事项。
由于木瓜蛋白酶活性中心含有半胱氨酸，属于巯基蛋白酶的。
半胱氨酸容易被氧化，而EDTA可以防止半胱氨酸氧化，所以实验要加入EDTA。
在实验中提高溶液的浓度更加有利于结晶和重结晶的。
3．盐析法分离与纯化蛋白质注意的几个问题
1）盐的饱和度：
盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。
分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀。
2）pH值：
在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出，因此，盐析时除个别情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。
3）蛋白质浓度：
在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限愈低
4）温度：
由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行，至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。
虽然蛋白质在盐析时对温度要求不太严格，但在中性盐下结晶纯化时，温度影响则比较明显。
5）脱盐：
蛋白质、酶用盐析法沉淀分离后，常需脱盐才能获得纯品。
4、对上述分离纯化方法进行评价。
实验二尼龙固定化木瓜蛋白酶及其应用研究
实验目的：
1、掌握尼龙为载体戊二醛为交联剂对木瓜蛋白酶进行固定化的方法。
2、了解检验固定化酶活力的方法。
一、材料与主要试剂
尼龙（6）或（66），市售140目。
木瓜蛋白酶，本室制备，比活力205U/mg蛋白。
啤酒。
酪蛋白（进口分装），戊二醛（E.Meyck），考马斯亮蓝G-250（sigma）等均为生化试剂或分析纯试剂。
二、方法
1、固定化木瓜蛋白酶制备
将尼龙布剪成约2g左右的小方块，置于干净培养皿中，用含18.6%CaCl2和18.6%水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干。
再用3.65mo1/LHCl水解45min，洗至pH中性，吸干。
用5%戊二醛（25%水的戊二醛溶液和硼酸缓冲液配制）20℃交联20min，用0.1mol/LpH7.8磷酸缓冲液洗除多余戊二醛。
将2g（一小块）处理尼龙布剪成小块放入1.5ml离心管中，立即加入1mg/mL酶液（0.1g木瓜蛋白酶溶于0.1mol/LpH7.2磷酸缓冲液并定容至100mL，活力44.7U/mL，比活力205U/mg蛋白）至满管，置于4-15℃冰箱中固定3h。
用0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液（含0.5mo1/LNaCl）洗至洗脱液在280nm波长处无光吸收，木瓜蛋白酶即固定在尼龙布上。
2、酶活力及蛋白质含量测定
取O.1mL酶液加入0.9mL激活剂（上述缓冲液内含20mmol/LCys,1mmol/LEDTA）37℃保温恒定，加人同样预热的1%（W/V）酪蛋白溶液（上述缓冲液配制））1mL,37℃反应10min，加人3mL10%三氛乙酸（（TCA）溶液终止反应（对照管先加TCA，后加底物）。
275nm波长下比色。
在上述条件下每增加1个光吸收单位的酶量为1个酶活力单位（U）。
取0.1g固定化酶加入1mL激活剂其余同溶液酶活力测定。
蛋白质含量测定，按考马斯亮蓝G-250法。
3、考马斯亮蓝G-250法
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶解于50mL95%乙醇中，再加入100mL85%（W/V）的磷酸，混匀，配成原液。
临用前取原液15mL，加蒸馏水稀释至100mL,双层滤纸过滤，即为缓冲液A，4℃保存。
0.5mg/mL标准牛血清白蛋白溶液的配制：
准确称取5mg牛血清白蛋白，溶解于适量的蒸馏水后，用缓冲液A定容至10mL。
（1）牛血清白蛋白标准曲线的测定
取6支试管，按下表加入标准蛋白溶液和缓冲液A。
管号
1
2
3
4
5
标准蛋白溶液/uL
40
80
120
160
200
缓冲液A/uL
500
460
420
380
340
300
标准蛋白含量/mg.mL-1
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
在各管中分别加入5mL缓冲液A，混匀，室温放置2min。
以0号管为空白对照，用1cm光程比色杯测量各样品在波长595nm下的吸光度A595。
以A595为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上标准曲线。
（2）样品蛋白质含量的测量
取样品溶液500uL,再加入5mL缓冲液，混匀，室温放置2min，测量其在波长595nm下的吸光度A595。
再根据标准曲线查出相当于标准蛋白的量，从而计算样品的蛋白质浓度（mg/mL）。
三、结果与讨论
1、固定化条件
（1．溶液酶浓度对固定化的影响：
随着酶浓度增长固定化酶的活力增加，但是活力回收下降。
（2.pH对固定化的影响:
为了使酶的活性回收率最大化，应该将pH调至到该酶的最适宜的pH，保证酶的稳定性和活性，提高回收率。
本实验选择PH7.2.
（3.刚开始随着固定时间的延长，固定化酶活力回收率增加达到最高。
再延长固定化时间，酶活力回收率基本不变化，本实验选择的是20min.
2、固定化酶的性质（Km值双倒数作图法）
3、固定化酶的效率
根据数据分析得出本实验的固定化酶的活力不是很高。
酶活实验结果是如表一：
实验对象
A275
对照管
1.004
标准管
1.119
固定化酶实验管
1.048
表一
0.001为一个酶活单位。
1.048-1.004=0.044。
固定化酶的活力为44U。
吸光值有些大，结果可能应该小于44U。
吸光值与蛋白质的含量如表二，ABS标准曲线如图一。
标准蛋白质含量mg.mL-1
A595
0.101
0.102
0.168
0.165
0.170
0.184
0.263
0.273
0.271
0.634
0.627
0.636
根据图表可以得出以下数据：
A595吸光值为0.11
蛋白质的含量mg/mL为0.066814
表二
图一：
ABS标准曲线
将A595吸光值0.11代入图一中公式，算出待测蛋白质的浓度为0.066814（mg/mL）。
R2＜0.99，所以结果有可能可够准确，但是蛋白质含量0.066814（mg/mL）左右，有蛋白质被分解，进一步说明酶被固定。
蛋白质减少量约为1-0.66814=0.33184mg。
讨论实验：
4、固定化酶的优缺点
（1）优点
①极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化；
②能够在较长时间内进行反应（分批反应和连续反应），便于实现连续化和自动化；
③大多数情况下，能够提高酶的稳定性；
④酶反应过程能够进行严格控制；
⑤酶的利用率提高，生产成本降低；
⑥能够进行多酶反应；
⑦可以增加产物的收率，提高产物的质量；
⑧只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，较不适宜多酶反应，特别是需要辅助因子的反应等。
（2）缺点
①固定化酶制备的成本一般较高，长期使用，酶活力会不断下降，必须补充，因此应用成本较高。
②固定化酶用于小分子底物较合适；
对于大分子底物，往往由于固定化带来的空间障碍，不易接触到酶，而要克服空间障碍，就必须在制备时采用适当的步骤，从而增加成本。
③目前固定化酶主要用于单一酶反应，多酶反应和需要辅因子的固定化，还缺乏成熟的技术。
酶工程实验所需仪器和材料
材料：
1.木瓜青果；
2.尼龙（6）或（66），市售140目3.浸过硫酸钙或杀菌剂溶液的洁净抹布4.啤酒
药品：
1.焦亚硫酸钠2.硅藻土和河沙3.半胱氨酸、4.（NH4）2SO45.NaCl6.EDTA.2Na7.磷酸氢二钠8.酪蛋白（进口分装）9.三氯醋酸（TCA）10.乙酸钠11.冰醋酸12.酪氨酸13.氢氧化钠14.石英砂15.磷酸氢二钠16.酪蛋白17.戊二醛（E.Meyck），18.考马斯亮蓝G-250（sigma）19.CaCl210.甲醇21.HCl22.磷酸缓冲液23.95%乙醇24.磷酸25牛血清白蛋白等均为生化试剂或分析纯试剂。
仪器：
1.刀片2.伞型收集盘3.60～80目筛4.ph计5.25ml，100ml容量瓶6.研钵7.高速冷冻离心机8.紫外分光光度计9.恒温水浴锅10.布氏漏斗
酶工程实验报告
指导老师：
张颖
学号：
200708302113
姓名：
黄江
班级：
07生物技术班
海南师范大学生命科学学院07级
2010-11-15
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