电镜与样品制备技术支持文档格式.docx

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　PH　　　6.4　6.66.87.0　7.27.4

甲液（ml）13.318.824.530.536.040.5

乙液（ml）36.731.225.519.514.09.5

磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用，常用于配制戊二醛固定液，并适于作灌注固定。

本缓冲液的缺点是固定时容易产生沉淀，并容易生长细菌，不能长期储存。

B、二甲胂酸盐缓冲液（0.2M）

二甲胂酸钠4.28g

加蒸馏水至100ml

0.2N盐酸

按表2混合甲、乙两液后，将总体积稀释成200ml即可获得不同PH的缓冲液

表2：

二甲胂酸钠缓冲液的配制

　　PH　6.46.66.87.07.27.4

甲液（ml）505050505050

乙液（ml）18.313.39.36.34.22.7

本缓冲液比较稳定，不易生长细菌，可长期保存，与低浓度的钙质（1-3mM）不发生沉淀反应。

缺点是胂有毒性、有臭味，配制时应在通风橱中进行。

⑵常用固定液的配制

A、0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为25%的水溶液）

表3：

0.1M磷酸缓冲戊二醛的配制

戊二醛最终浓度（%）1.01.52.02.53.04.05.0

0.2M磷酸缓冲液（ml）50505050505050

25%戊二醛水溶液（ml）46810121620

双蒸水加至（ml）100100100100100100100

B、0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液

表4：

0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液的配制

戊二醛最终浓度（%）1.01.52.02.53.0

0.2M二甲胂酸钠缓冲液（ml）5050505050

25%戊二醛水溶液（ml）　　　4681012

双蒸水加至（ml）　　　100100100100100

C、多聚甲醛-戊二醛固定液

取2克多聚甲醛粉末溶于25毫升蒸馏水，65℃下不断搅拌，加1-3滴1N氢氧化钠，使溶液透明，冷却后加5毫升5%戊二醛，加二甲胂酸缓冲液或磷酸缓冲液（0.2M，pH7.2-7.6）使总体积到50毫升，并加25毫克无水氯化钙。

混合液的pH为7.2。

本液对微管有良好的保存作用。

透射电镜的成像原理　

目前，主流的透射电镜镜筒是电子枪室和由6～8级成像透镜以及观察室等组成。

阴极灯丝在灯丝加热电流作用下发射电子束，该电子束在阳极加速高压的加速下向下高速运动，经过第一聚光镜和第二聚光镜的会聚作用使电子束聚焦在样品上，透过样品的电子束再经过物镜、第一中间镜、第二中间镜和投影镜四级放大后在荧光屏上成像。

电镜总的放大倍数是这四级放大透镜各级放大倍数的乘机，因此透射电镜有着更高的放大范围（200×

～1000000×

）。

透射电镜的一般操作流程

接通电镜工作电源后，电镜开始通过机械泵抽前级和镜筒真空，当镜筒真空达到一定要求时，再由扩散泵抽镜筒的高真空，当高真空能达到加高压的要求时，面板上高真空指示灯点亮，表明此时可以加高压了，接通高压并调整高压到合适的高压值，稍等一会待高压稳定后，再增加灯丝电流，使荧光屏中心产生一个明亮的光斑，随后依次接通各级透镜的工作电流，调整电镜的工作状态，调整好后再加入样品进行观察，并对感兴趣的部位拍照记录。

电镜使用完毕，应依次关闭高压、灯丝加热电流、关闭各级透镜工作电流以及取出样品。

待冷却水再工作10～15min后，关闭电镜和冷却水。

电镜在生物医学领域中的应用

17世纪光学显微镜的发明，促进了细胞学的发展，20世纪电子显微镜的发明，揭开了病毒和细胞亚显微结构的奥妙。

在20世纪60年代以来，电镜广泛应用于工农业生产、材料学、考古学、生物学、组织学、病毒学、病理学和分子生物学等众多研究领域中。

但电镜技术从应用的广度、研究的深度等方面看，没有哪一个领域可与生物医学相媲美。

1在细胞学方面：

由于超薄切片技术的出现和发展，人类利用电镜对细胞进行了更深入的研究，观察到了过去无法看清楚的细胞超微结构。

例如，用电镜观察到了生物膜的三层结构以及细胞内的各种细胞器的形态学结构等。

2电镜在发现和识别病毒方面起到了重要作用：

许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用电镜发现的。

电镜也为病毒的分类提供了最直观的依据，例如去年肆虐全球的SARS病毒就是首先在电镜下观察到并确认是病毒而不是支原体的。

3在临床病理诊断方面：

生物体发生疾病都会导致细胞发生形态和功能上的改变，通过对病变区细胞的电镜观察就可以为疾病诊断提供有力依据。

例如目前电镜在肾活检、肿瘤诊治中发挥了重要作用。

4电镜技术与生命科学中新兴起的技术相结合，促进了新技术的应用。

例如电镜技术与免疫学技术相结合产生了免疫电镜技术，它可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，可以了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况等。

透射电镜在生物医学研究中的主要技术

1常规超薄切片技术

一般的透射电镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须切成厚度为50~70nm的超薄片，这种制作超薄片的技术称为超薄切片技术。

在透射电镜的生物医学样品制备方法中，超薄切片技术是最基本最常用的制备技术，其他一些样品制备技术，如细胞化学技术，免疫电镜技术及电镜放射自显影技术都离不开超薄切片的制作。

利用透射电镜观察超薄切片，可以了解细胞的精细结构。

2负染色技术

负染色技术也叫阴性反差染色，它是由Hall等首先采用的一种染色技术，与超薄切片法相比，该技术具有分辨率高、简单易行和快速方便等优点。

因此在生物学研究中广泛应用。

这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、原生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特征。

尤其是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的相互作用等的研究中，负染色更是不可缺少的实验技术。

3金属投影与复型技术

金属投影技术是利用真空喷镀仪对样品进行投影的一种技术，Williams首先用这种技术用于增加电镜图象的反差。

该技术还可用来测量颗粒及大分子的大小。

复型技术主要用于样品表面结构的研究。

某些坚硬的材料，如牙齿、骨骼、金属等，它们是不透明的，并且很难制成超薄切片，对于这些材料可用一种电子透明的薄膜将其表面结构复制下来，即成复型。

通过对该复型样品的观察，就可以了解原有样品的天然断面或人工断面的结构特征。

4冷冻切片技术和冷冻蚀刻复型技术

冷冻切片技术是使样品迅速冷却，然后用冷冻切片机进行冷冻切片，它省去了普通超薄切片中繁杂的化学固定与包埋操作。

该技术在细胞化学研究中有着特殊用途。

冷冻蚀刻复型技术是一种冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术，该技术在生物学中的广泛应用不仅验证了超薄切片所展示的细胞超微结构，而且还揭示了某些前所未见的新结构，尤其是在显示生物膜的结构方面，该技术有着独特作用。

5电镜细胞化学技术

电镜细胞化学技术又称超微结构细胞化学技术，它是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，它的任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。

其中最主要的是蛋白质（尤其是酶的细胞内定位），其次是核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子的定位。

该技术有利的促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。

6免疫电镜技术

免疫电镜技术是通过特殊的标记方法使抗体与电子致密的标记物相结合，然后利用电镜在超微微结构水平上鉴定抗原-抗体的结合反应。

在免疫学领域中，这是一种非常有用的实验技术。

7电镜放射自显影技术

电镜放射自显影技术是一种利用放射性同位素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。

这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，而且还用于显示抗原-抗体的结合，激素或药物与受体的结合，显示病毒的感染与复制部位等。

因此这是一种非常有用的现代生物学技术。

体金标记免疫电镜

包埋前胶体金标记免疫电镜

胶体金探针（>

3nm）即使在使用穿透剂的情况下也不易穿透细胞，因此常常用于细胞表面抗原的标记。

20世纪90年代，国外成功制备了1nm金标记的探针，这种探针容易穿透组织和细胞，已成功应用于标记细胞内抗原。

包埋前免疫标记时，在标本未作固定或轻微固定后进行免疫标记，标记后再用2％戊二醛+2％多聚甲醛固定以获得较好的超微结构保存。

这种方法特别适用于标记对固定剂敏感的抗原。

在标记细胞膜表面成分时，应注意免疫标记可能会引起细胞膜成分的重分布，抗体与未固定或轻微固定的细胞膜成分的结合可能会引起这些分子的聚集、成帽或内吞。

通常用含低浓度戊二醛的固定液作短暂固定，能有效防止膜分子的重分布。

单独用多聚甲醛固定或在4℃做免疫标记不足以防止质膜分子向周边扩散。

细胞表面抗原标记（间接法）

•细胞用PBS洗两次，用0.5％戊二醛+2％多聚甲醛在室温下固定0.5～lh。

可根据抗原对固定剂的敏感度选择恰当的固定液，对某些抗原可完全不用戊二醛，用4％多聚甲醛固定1～4h。

•用PBS漂洗3～5次，每次20min。

•用0.1mol/L甘氨酸漂洗细胞5min，灭活自由醛基。

这一步骤对用戊二醛固定的细胞尤为重要，因为戊二醛含有两个醛基，在固定时其中的一个醛基可能与细胞成分结合，而留下一个自由的醛基，若这个自由的醛基不被阻断，则能与阻断液中的蛋白或抗体结合，从而增加非特异性背景染色。

•用含1％BSA的无钙镁Dulbecco'

sPBS漂洗细胞15min，以阻断对一抗的非特异性结合。

阻断液可以是2％～10％BSA，也可以是卵蛋白（OVA）、正常血清或IgG片段。

•室温下用适当稀释的第一抗体孵育细胞1～2h，用无钙镁Dulbecco'

sPBS漂洗细胞5次，每次5min，以除去未结合的一抗。

如果非特异性染色背景很高，可在漂洗液中加入0.1mol/LEDTA。

•室温下用适当稀释的胶体金探针（可以选择二抗-胶体金、蛋白A-胶体金或蛋白G-胶体金）孵育细胞30min。

•用无钙镁Dulbecco'

sPBS漂洗细胞5次，每次5min。

•室温下用2％戊二醛+2％多聚甲醛（用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制，pH7.4）再次固定细胞1h。

•用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，1％锇酸后固定，常规脱水包埋，超薄切片铀铅染色后透射电镜下观察。

也可按常规扫描样品制备方法处理，在扫描电镜下观察细胞表面的胶体金标记情况，由于扫描电镜分辨率的限制，应选用40nm以上的胶体金或采用银加强染色法。

•对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。

细胞表面抗原标记（直接法）

•按间接法前4步操作。

•室温下用适当稀释的第一抗体-胶体金复合物孵育细胞lh。

•按间接法步骤7～10操作。

纳金（超微金）-银加强法标记细胞内抗原（0chs等，1994年）

•将单个盖玻片放人直径为35mm的皮氏培养皿中，加入3ml培养液。

•培养2～3d后，用PBS洗单层细胞，然后用3％的甲醛（由对甲醛新配制而成）室温下固定30min，用PBS（pH7.4）缓冲液改变戊二醛的含量（0.01％～0.5％）。

•用来检验每种抗原的戊二醛浓度并不相同，但戊二醛浓度越高，固定效果越好。

应有一份不加戊二醛的样本作为阳性对照，因为大多数抗原都能被戊二醛固定。

固定时溶液的pH值应与细胞生长时的pH值一样。

•用PBS洗细胞三次，每次10min，用35mmol／L的甘氨酸或1mg／ml的NaBH4/PBS液猝灭三次，每次5min。

•室温下用0.2％的TritonX-100/PBS液渗透细胞5min。

•用PBS洗细胞3次，每次5min。

•室温下用1％的正常羊血清（NGS）/PBS液（NGS/PBS）封闭细胞30min。

•用在1％NGS/PBS稀释下的一抗孵育细胞，室温下1h或4℃过夜。

•PBS洗细胞3次，每次5min。

•用1％的NGS/PBS封闭细胞30min。

•用与抗人、抗鼠或抗兔Fab共价相连的1.4nm超微金颗粒在1％，NGS/PBS中稀释成1/100，室温下摇动培育细胞1h。

•用l％的戊二醛/PBS固定细胞30min。

•用PBS洗3次，每次5min。

•用双蒸水洗3次，每次5min。

•室温下避光用HQ银[根据厂商说明（Nanophobes）]进行银增强，3～4min，时间越长，银包被的金颗粒就越大。

•水洗3次，每次5min，终止银反应。

•用1％的OsO4的二甲胂酸盐缓冲液，pH7.3，固定样本30min。

•用水洗样本3次，每次5min。

•用乙醇脱水，Epon812包埋。

•检查由柠檬酸铅和醋酸铀染色的或未染色的薄切片。

•金颗粒标记可以通过EM底片进行定量分析，分析结果可表示为“金颗粒数/μm2”。

包埋后胶体金标记免疫电镜

包埋后免疫胶体金标记是应用最广泛的免疫电镜技术，标本经固定、包埋、切片后在超薄切片上进行免疫标记。

包埋后免疫胶体金标记也可分为直接法和间接法两种：

直接法是用与胶体金交联的第一抗体直接进行标记；

间接法是用不带标记物的第一抗体先与组织反应，然后用胶体金标记的第二抗体或第三抗体、蛋白A或蛋白G等特异性结合第一抗体，因此只要制备一种胶体金探针就能用于许多抗原的标记，方法更为简便，且敏感性比直接法高。

蛋白A和蛋白G的胶体金探针是包埋后免疫胶体金标记中应用最广的第二试剂，它们对不同种抗体的亲和力，可根据一抗的种类选择合适的胶体金探针。

抗体-胶体金探针也较常用，但其稳定性不如蛋白A-胶体金探针。

此外，胶体金标记的亲和素（avidin）、凝集素（1ectins）以及酶也曾被应用于包埋后标记。

标准方法

•标本用固定液在室温或4℃下固定1～6h。

•标本用PBS漂洗3次，每次10min。

•用0.1mol/L甘氨酸漂洗标本20～30min，封闭残留的自由醛基。

•用PBS漂洗标本3次，每次10min。

•低温脱水：

4℃，30％乙醇脱水10min；

4℃，50％乙醇脱水30min；

-20℃，70％乙醇脱水1h；

-35℃，90％乙醇脱水1h；

-35℃，100％乙醇脱水1h。

•低温渗透：

-35℃，以1：

1和1：

2的无水乙醇：

低温包埋剂（LRWhite，LRGold，Lowicryl）各渗透1h；

纯低温包埋剂渗透1h；

纯低温包埋剂渗透过夜。

•包埋、聚合：

明胶胶囊作包埋模具，紫外灯聚合箱内，用365nm紫外灯进行光聚合，在-35℃下聚合1～2天，转入室温再聚合2～3天。

•超薄切片：

切片的厚度较一般的略为厚一点（切片的光干涉色呈淡金黄色），将切片捞在镍网上。

•蚀刻（此步可省略）：

用于蚀刻的溶液有三种：

饱和过碘酸钠水溶液、1％H2O2、乙醇盐，目的是暴露切片内部的抗原、使试剂能穿透标本，但此步处理常会使超微结构受到破坏，且会影响抗原性。

若非必要，一般不作蚀刻。

蚀刻的作法是，在parafilm或蜡片上滴一滴用于蚀刻的液体，然后将带有切片的镍网轻轻漂浮在液滴上（有切片的一面向下）。

蚀刻后直至免疫标记完成，镍网应始终保持湿润状态，否则易出现难以清洗的非特异性反应。

•用去离子双蒸水漂洗切片3～5次。

•切片用1％BSA或5％正常血清（无钙镁Dulbecco'

sPBS或TBS配制）孵育15～30min以阻断对第一抗体的非特异性结合。

BrorsonSH建议用5％BSA孵育1h以去除非特异性标记，BSA的浓度过高或孵育时间过长可能会使标记率下降。

•用适当稀释的第一抗体室温孵育l～2h。

一抗用含0.1％BSA的无钙镁Dulbecco'

sPBS或TBS稀释。

sPBS或TBS漂洗切片6次。

•室温下用适当稀释的胶体金探针（可以选择二抗-胶体金、SPA-胶体金或蛋白G-胶体金）孵育30～60min。

•漂洗同上步骤。

•用去离子双蒸水冲洗切片。

•用醋酸铀和硝酸铅染色后在透射电镜下观察。

•对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。

链霉亲和素-胶体金法

生物素-亲和素（biotin-avidin）检测系统已被广泛应用于免疫细胞化学和分子生物学。

该系统利用生物素与亲和素之间的高度亲和力（解离常数：

10-15）而建立的。

亲和素会与许多组织非特异性结合，这主要是由于它是一种糖基化的蛋白，而且具有很高的等电点（pI=10）。

由于亲和素的非特异性结合问题，目前亲和素已基本被链霉亲和素（streptavidin）所代替。

链霉亲和素具有同亲和素类似的特性，但没有糖基化，几乎没有非特异性结合。

链霉亲和素-胶体金检测系统常在包埋后免疫细胞化学中应用，这个系统常常由不作标记的一抗、生物素化的二抗和链霉亲和素-胶体金组成，也可不用二抗，直接使用生物素化的一抗和链霉亲和素-胶体金。

该系统所需的试剂都已商品化，可以从试剂公司购买得到。

•按以上标准方法中的前12步操作。

•室温下，用适当稀释的二抗-生物素孵育切片30min。

sPBS或TBS冲洗切片5次。

•室温下用适当稀释的链霉亲和素-胶体金探针孵育30min。

•醋酸铀、枸缘酸铅染色后在透射电镜下观察结果。

双重或多重免疫标记法

由于在制备过程中胶体金颗粒的直径可以控制，因此就可以利用不同大小的胶体金颗粒做双重免疫标记甚至三重免疫标记。

做双重免疫标记时，一般选择5nm和15nm胶体金，在透射电镜下很容易区分这两种胶体金。

做三重免疫标记时，则选择5nm、10nm和15nm胶体金。

应使用经蔗糖梯度离心纯化得到的大小均一的胶体金探针。

双重或多重免疫标记有多种方法，如直接法、间接法、双面双重标记法等。

间接法必须在第一种抗原被标记完成后用甲醛蒸气阻断可能存在的游离的第一抗体结合位点，阻断的时间必须控制好，时间太短则会造成交叉免疫反应，太长则会影响后一种抗原的标记率。

双面双重标记法在操作时必须非常小心，不能弄混标记面，且不能将抗体沾到另一面，否则会影响结果的准确性。

鉴于以上原因，推荐采用直接法进行双重标记，标记效果好，对阳性结果容易做出正确的判断和分析。

直接法是将针对两种或三种抗原的抗体分别与不同直径的胶体金结合，然后直接进行免疫标记。

免疫标记时先将切片与一种抗体-胶体金孵育，用TBS漂洗后再与另一种抗体-胶体金孵育，其他步骤同包埋后免疫胶体金单标记法。

酶标记免疫电镜

组织抗原的包埋前免疫酶标记

•固定：

免疫电镜通常采用4％多聚甲醛和低浓度的戊二醛（0.1％～0.5％）混合液灌注固定。

PBS充分洗涤。

•预切片：

用振动切片机将样品切成40～60μm的厚片。

•正常山羊血清（1：

20）室温30min。

•加入适当稀释的第一抗体，置冰箱（4℃）内24h。

•加入稀释好的HRP标记的第二抗体。

室温1h。

•2.5％戊二醛后固定15～30min。

•0.75mg/ml的DAB溶液，室温避光反应15min。

•加等量DAB溶液，内含0.02％H2O2（加入后最终浓度为0.01％），室温避光反应15～20min。

•在解剖显微镜下观察免疫反应阳性部位并取下。

•用1％锇酸（pH7.4）后固定0.5～1h。

•梯度乙醇或丙酮脱水。

•环氧树脂包埋。

•超薄切片，铀、铅染色或单染或不染。

•电镜观察。

组织抗原的包埋后免疫酶标记

•新鲜组织经固定后（勿用OsO4后固定），低温下进行梯度乙醇脱水，用低温包埋剂进行包埋、光聚合，超薄切片（用镍网捞片）。

•正常山羊血清（1：

20，用pH7.6的0.02mol/LTBS稀释）室温孵育5～15min。

•加入适当稀释的第一抗体（兔抗血清）（用含1％正常山羊血清的0.02mol/LTBS）4℃孵育过夜，然后用TBS漂洗。

•山羊抗免IgG（稀释液同一抗）室温30～60min，然后用TBS洗涤。

•兔PAP复合物（稀释液同一抗）室温30min后用TBS洗涤。

•DAB－4HCl/$H_2O$（0.0125％/0.0025％）室温15min后用TBS洗。

•1％OsO4固定10～15min。

水洗后用醋酸铀单染或不染。

•电镜观察。

对照实验：

•吸收实验：

将足量的抗原如P物质加入抗P物质的抗血清内，离心取其上清液，用这样的血清代替一抗，结果应为阴性。

•替换试验：

用正常血清为第一抗体，结果为阴性。

冷冻超薄切片免疫电镜

在包埋前免疫标记中要用化学的或物理的方法增加膜的通透性，在包埋后免疫标记条件下，又需经化学剂脱水、包埋剂渗透聚合后再进行免疫标记，这样处理都可能对蛋白质的抗原性带来危害。

采用免疫冷冻超薄切片技术可以避免这些缺点，显示上述方法所不能显示的抗原。

冷冻超薄切片是用冰冻的、经过固定但未经包埋的组织切成的，在免疫标记后再将切片加以包埋，以防止切片干燥收缩引起的结构改变。

该方法进行的顺序是固定、蔗糖浸泡、切片、切片收集、免疫标记和重金属染色。

在切冷冻超薄切片之前，最好先用冷冻半薄切片做免疫荧光标记以确定阳性部位。

由于戊二醛能发射荧光，故凡经戊二醛固定的标本，在免疫标记前需用NaBH4阻断此作用。

冷冻超薄切片免疫标记的主要步骤。

为叙述方便，抗原、抗体、蛋白质A和金颗粒分别用AG、AB、PA和g来表