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毕业（设计）附件材料
花生网斑病病原鉴定及促进产孢实验
农学与植物保护学院
20XX3080
20XX年3月10日
青岛农业大学毕业（设计）立题表
立题题目
花生网斑病病原鉴定及促进产孢实验
题目来源
来源于生产实际□来源于科研项目□其他
题目性质
基础研究□应用研究□应用基础研究□其他
题目完成形式
毕业□
申请立题教师
职称
从事专业
立题说明：
教研室意见
教研室主任签名：
毕业（设计）领导工作小组意见：
教学院长签名：
青岛农业大学毕业（设计）任务书
（设计）题目花生网斑病病原鉴定及促进产孢实验
要求完成时间20XX年3月20日
（设计）内容（需明确列出研究的问题）：
20XX年6月5日—20XX年6月30日：
花生网斑病病原的分离、纯化。
20XX年7月1日—20XX年7月20日：
对花生网斑病病原进行致病性测定。
20XX年7月21日—20XX年9月30日：
在不同培养条件下对花生网斑病病原进行产孢培养并进行孢子计数及病原菌的鉴定。
资料、数据、技术水平等方面的要求
指导教师签名：
毕业（设计）开题报告
20XX年6月3日
说明
一、有关说明
毕业（设计）题目确定后，学生应尽快征求导师意见，讨论题意与整个毕业（或设计）的工作计划，然后根据课题要求查阅、收集有关资料并编写研究提纲，主要由以下几个部分构成：
1.研究（或设计）的目的与意义。
应说明此项研究（或设计）在生产实践上或对某些技术进行改革带来的经济、生态与社会效益。
有的课题过去曾进行过，但缺乏研究，现在可以在理论上做些探讨，说明其对科学发展的意义。
2.国内外同类研究（或同类设计）的概况综述。
在广泛查阅有关文献后，对该类课题研究（或设计）已取得的成就与尚存在的问题进行简要综述，只对本人所承担的课题或设计部分的已有成果与存在问题有条理地进行阐述，并提出自己对一些问题的看法。
3.课题研究（或设计）的内容。
要具体写出将在哪些方面开展研究，要重点突出。
研究的主要内容应是物所能及、力所能及、能按时完成的，并要考虑与其它同学的互助、合作。
4.研究（或设计）方法。
科学的研究方法或切合实际的具有新意的设计方法，是获得高质量研究成果或高水平设计成就的关键。
因此，在开始实践前，学生必须熟悉研究（或设计）方法，以避免蛮干造成返工，或得不到成果，甚至于写不出毕业或完不成设计任务。
5.实施计划。
要在研究提纲中按研究（或设计）内容落实具体时间与地点，有计划地进行工作。
二、注意事项
1.开题报告的撰写完成，意味着毕业（设计）工作已经开始，学生已对整个毕业（设计）工作有了周密的思考，是完成毕业（设计）关键的环节。
在开题报告的编写中指导教师只可提示，不可包办代替。
2.无开题报告者，不准申请答辩。
3.本表要用计算机填写，签字要手写，一式三份，本人、导师、所在学院（要原件）各一份。
4．学生可根据内容的多少调整表格的大小。
一、选题依据（拟开展研究项目的研究目的、意义等）
花生网斑病（PhomaarachidicolaMarasas,Pauer&
Boerema）是我国近年来新发生的一种严重危害花生的叶部病害。
该病原菌在培养基上产孢难限制了实验室研究的展开。
另外，对该病原菌有性阶段的分类地位、以及致病性不明确。
鉴于花生网斑病菌在培养基上难以产孢，且对其有性阶段的分类地位不明确，本试验的主要目的是探索不同培养基及培养条件对花生网斑病菌产孢的影响，以及有性孢子的分类地位以及在病害侵染中的作用。
本实验可以为下一步展开生物学特性及侵染机制比较研究奠定了一定的基础。
二、国内外同类研究或同类设计的概况综述（在充分收集研究主题相关资料的基础上，分析国内外研究现状，提出问题，找到研究主题的切入点，附主要参考文献）
花生（Arachishypogaea）是重要的油料和经济作物，在世界范围内都有广泛种植，据20XX年统计，全世界的花生种植面积已达到2200多万hm2。
我国花生的种植面积位居世界第2，目前除西藏、青海和宁夏外，其他各省、自治区、直辖市均有一定规模的种植。
花生网斑病（PhomaarachidicolaMarasasPauer＆Boerema），又称云斑病、褐纹病、污斑病，是我国近年来新发生的一种花生叶部病害，是花生上最严重的病害之一，多数花生品种都极易感染此病害。
1973年在德克萨斯州首次发现，其后在佛罗里达州、乔治亚州、新墨西哥州、俄克拉荷马州和维吉尼亚也发现了该病害。
1982年，我国在山东、辽宁等花生产区首次发现该病，随后在陕西、河南也有报道[1~3]。
在我国，花生网斑病主要导致花生生长后期大量落叶，影响产量，一般可减产10%～20%，严重的达30%以上，给花生生产造成巨大损失[4~5]。
为了控制该病的发生与危害，诸多国内外学者致力于花生网斑病的系统研究，现已逐步明确了该病菌的分类地位，病害症状、发生规律、危害特点以及综合防治措施等。
花生网斑病是一种真菌性叶部病害，在花生整个生长期均可发生，以花生中后期发病最重，主要危害叶片，其次危害叶柄和茎部，主要分为两种类型。
第一种为网纹型:
发病初期在叶片正面先产生一星芒状小黑点，渐次扩大而成黑褐色、边缘成网状、不整齐而模糊的斑。
病斑不穿透叶片，这种病征多发生在发病初期或少雨而干早的中后期。
第二种为污斑型:
病斑较大，在0.7~1.5cm，近园形，黑褐色，病斑边缘较清晰。
病斑穿透叶片，但叶背面斑较小，老病斑质脆易碎，在病斑的坏死部分上有时出现小黑点，即分生孢子器。
把有污斑型病斑的叶片组织用棉兰染色，可观察到污斑型的产生是菌丝深入侵害叶片栅栏细胞的结果，因而叶片产生较大面积的坏死，并可穿透叶片背面。
污斑型的产生，多处于高温多湿的夏季，相对湿度在90％以上是产生污斑型病斑的主要因素。
污斑型病斑的大量出现，说明当时的条件适于病害的发展和流行[6]。
国际上曾对花生网斑病病原的鉴定结果不一致。
其无性阶段最初被鉴定为壳二孢属（Ascochytaspp.）。
后来发现该病原菌的孢子类型可随环境条件而变化，在大田条件下，病叶上的分生孢子，一双胞为主，而在人工培养基上，分生孢子以单胞为主。
后来Berwer和Boerema用发生学测定方法做了重新鉴定：
根据是壳二孢的产孢方式是全壁芽生环痕式，而茎点霉属的产孢方式为内壁芽生瓶体式，因此划分为茎点霉属（Phoma）。
在我国，徐秀娟等也将该病原鉴定为PhomaarachidicolaMarasasPauer＆Boerema，这与国际上已确定的花生网斑病病原相同[7~9]。
在自然条件下，病组织上产生在的分生孢子器为褐色，分生孢子器球形，埋生，具孔口，平均直径为148.7µ
m（总体在50~200µ
m之间）。
分生孢子器产生无色，长椭圆形的分生孢子，分生孢子多为双胞，少数单胞，分隔处稍缢缩，分生孢子大小为13.0×
3.9µ
m。
在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，产生黑褐色，球形，具孔口的分生孢子器，它的直径范围为85.6~214.0µ
分生孢子器产生椭圆形，无色的分生孢子，大多单胞，极少数双胞，大小范围是3.3~9.1×
2.0~3.4µ
在培养基上产生大量的近球形，褐色，光滑，顶生或间生，单生或串生的厚垣孢子，厚垣孢子也可聚集成团。
对于该病原菌有性阶段的分类地位目前尚不明确，曾有报道为属于球腔菌属Mycosphaerella、隔孢球壳属Didymosphaeria或亚隔孢壳属Didymella。
曾经有报道称，有性阶段的子囊壳呈深褐色，球状，有短嘴或无嘴，单生，直径为65~154µ
m，埋生于寄主表皮下。
子囊呈柱状或棍棒状，多数子囊有1个分化的足胞，大小为10~17×
35~60µ
子囊孢子为椭圆形，大小为5~7×
12.5~16µ
m，有1个隔膜，光滑，透明至淡黄色，随着成熟而变暗。
但该阶段在病害侵染中不起作用[1]。
参考文献：
[1]徐秀娟主编.中国花生病虫草鼠害[M].北京:
中国农业出版社,20XX,49.[2]范文忠,程丽,李云江.不同碳源氮源对花生网斑病生长的影响[J].安徽农业科学,20XX,39（26）:
16020-16021.
[3]孙晓会.花生主要病虫害及防治措施[J].中国果菜,20XX,（9）:
18-21.
[4]吴献忠,张卫,李荣花,等.花生网斑病研究进展[J].莱阳农学院学报,2000,17（4）:
294-297.
[5]傅俊范,杨凤艳,周如军,等.辽宁花生病虫发生危害及种类鉴定[J],植物保护,20XX,39
（1）:
144-147.
[6]何健三.关于花生网纹污斑病的研究与讨论[J].花生科技,1988（4）:
12-16.
[7]全鑫,宋玉立,何文兰.花生网斑病国内外研究进展[J].河南农业科,20XX（7）:
13-16.
[8]王振跃,王守正.河南省花生网斑病的初步研究[J].河南农业科技,1993,2（7）:
23—25.
[9]曹玉良.花生品种间关联性的研究[J].花生科技,1998,1（4）:
l-4.
[10]李君彦,李有志,焦锋,王翠芸.陕西省花生网斑病病原菌的研究[J].花生科技,1991,
（1）:
1~6.
三、研究方案（研究内容、目标、研究方法、技术路线、拟解决的问题、特色或创新点等）
1.1材料
1.1.1材料
花生（品种为白沙1016），玉米粉，琼脂，燕麦片，蔗糖，马铃薯，葡萄糖等。
1.1.2仪器
光照培养箱，立式压力蒸汽灭菌锅，Olympus光学显微镜，LETCAICC50HD摄像显微镜等。
1.2花生网斑病病原菌的分离、纯化
对20XX年田间发病的花生网斑病病叶进行分离、纯化。
分离纯化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），制作步骤如下：
（1）根据培养基配方，计算好各种成分的量及要求配置的总量，分别秤取或量取马铃薯200g，琼脂12.0g，葡萄糖20.0g，加自来水至1000mL。
（2）将马铃薯切成1cm边长的块状加入自来水中，文火煮沸后计时30min
（3）趁热用四层纱布过滤，将滤液用蒸馏水定容至1000mL。
（4）再把培养基转移至锅内，加入琼脂粉，在加热的过程中不断搅拌，待充分溶解后加入葡萄糖，并搅拌均匀。
（5）分装，将配置好的培养基装入三角瓶，封口。
（6）高压蒸汽灭菌。
121℃灭菌20min。
1.2.1病原菌的分离、纯化
（1）分离试验开始前，将PDA培养基在微波炉中加热融化。
（2）分离纯化实验要在超净工作台进行无菌操作，将所需物品按次放在工作台上，进行实验之前要提前打开紫外灯照射消毒15min。
（3）保证自身洁净，用肥皂洗净双手，再用70%酒精擦手及所需工具。
（4）在超净工作台上将冷却好的培养基倒入灭过菌的培养皿，形成2~3mm厚的平板，静置冷却使其凝固。
要在酒精灯火焰旁边操作，避免造成污染。
（5）实验材料选择发病花生叶片上单个的网斑病斑，以减少杂菌污染。
用刀片在花生叶的病健交界处切取约5mm大小的组织块。
将组织块在酒精中浸泡20s，取出后在0.1%升汞溶液里浸泡2~3min进行表面消毒，操作注意安全并且注意回收升汞。
再将组织块在无菌水中冲洗3次，将组织块用镊子捣碎，接种时尽量使用小的组织块。
用无菌操作法将病组织接种到培养皿上，每皿接种2~3块，均匀分布在皿中。
盖上皿盖，用保鲜膜封口，倒置在25℃恒温培养箱中，培养3~4天左右，观察待分离菌生长情况。
分离、纯化后得到两种纯培养物，经对二者进行致病性测定，发现均可使离体花生叶片致病，且致病后症状相同，将其分别编号为A、B。
1.2.2不同培养条件对花生网斑病菌产孢的影响
1.2.2.1培养基的制备
选用3种产孢培养基，分别为玉米培养基、燕麦培养基和花生叶汁培养基（自制）。
（1）玉米培养基的制备
1）根据培养基配方，计算好各种成分的量及要求配置的总量，分别秤取或量取玉米粉100.0g，琼脂粉12.0g，加自来水至1000mL。
2）在锅内加入一定量的自来水煮沸，再加入100g玉米粉，搅拌均匀，文火煮沸后计时1h。
3）趁热用四层纱布过滤，将滤液用自来水定容至1000mL。
4）再把滤液转移至锅内，加入琼脂粉，加热过程中不断搅拌至充分溶解。
5）用1mol/LNaOH或1mol/L的HCl调节pH值至6.5。
6）分装，将配置好的培养基装入三角瓶，封口。
7）高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min。
（2）燕麦培养基的制备
1）根据培养基配方，计算好各种成分的量及要求配置的总量，分别秤取或量取燕麦片30g，琼脂粉12g，加自来水至1000mL。
2）在锅内加入1000mL自来水煮沸，再加入30g燕麦片，搅拌均匀，文火煮沸后计时1h。
3）趁热用四层纱布过滤，将滤液用自来水定容至1000mL。
4）再把滤液转移至锅内，加入琼脂粉并不断搅拌至琼脂溶化。
5）用1mol/LNaOH或1mol/L的HCl调节pH值至6.5
6）分装，将配置好的培养基装入三角瓶，封口。
7）高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min。
备用
（3）花生叶汁培养基的制备
1）根据培养基配方，计算好各种成分的量及要求配置的总量，分别秤取或量取花生叶31.09g，马铃薯200g，琼脂12g，葡萄糖20g，自来水定容至1000mL。
2）将马铃薯切成1cm边长的块状和洗净的花生叶片一起加入蒸馏水中，文火煮沸后计时30min。
3）趁热用四层纱布过滤，将滤液用蒸馏水定容至1000mL。
4）再把滤液转移至锅内，加入琼脂粉，不停地搅拌，直至溶化。
5）再用1mol/LNaOH或1mol/L的HCl调节pH值至6.5。
1.2.2.2培养条件设计
培养条件有三种，分别是光暗交替（12h/12h），黑暗，近紫外光，均置于25℃恒温培养箱培养。
1.2.2.3病原菌产孢培养试验设计
A和B两种病原菌的产孢培养方案如下表：
表1网斑病病原菌诱发产孢培养试验设计
光暗交替（12h/12h）
黑暗条件
近紫外光条件
玉米琼脂培养基
（1）
（2）
（3）
燕麦培养基
花生叶汁培基
注：
（1）、
（2）、（3）表示每个处理有三个重复。
1.2.2.4病原菌的产孢培养方法
A和B两种病原菌的产孢方培养方法为：
1）分离试验开始前，将玉米琼脂培养基、燕麦培养基和花生叶汁培养基在微波炉中加热融化。
2）产孢培养在超净工作台进行无菌操作，将所需物品按次放在工作台上，进行实验之前要提前打开紫外灯照射消毒15min。
3）保证自身洁净，用肥皂洗净双手，再用70%酒精擦手及所需工具。
4）在超净工作台上将冷却好的培养基倒入灭过菌的培养皿，形成2~3mm厚的平板，静置冷却使其凝固。
5）挑取花生网斑病原菌A和B纯培养物，在无菌条件下分别接种到上述三种不同的培养基上，每个处理3个重复。
1.3病原菌的孢子计数
用血球计数板计数法对A和B在不同情况下进行孢子计数。
血球计数板计数方法如下：
（1）孢子悬浮液的制备。
刮取整个培养基上的小黑点置于研钵中研磨，使其中的分生孢子或子囊孢子释放出来，然后加入定量无菌水配制成孢子悬浮液。
（2）检查血球计数板。
取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。
镜检清洗后的计数板。
直至计数室无污物时才可以使用。
（3）加样品。
取出一块干净盖玻片在计数板中央。
用细口滴管取一滴已充分摇匀的菌悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行深入计数室，静止5~10min，带菌体自然沉降并稳定后即可计数。
（4）显微镜计数。
加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。
每个计数室选5个中格中的菌体进行计数，每个样品重复3次。
位于线上的菌体一般只数上方和右边线上的。
（5）计算。
设5个中方格中的总菌数为X，菌液稀释倍数为Y，本实验的计数板为25个中格，则：
1mL菌液中的总菌数﹦（X/5）×
25×
104×
B﹦50000A×
B（个）
（6）清洗血球计数板。
使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。
镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。
若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
1.4病原菌鉴定
挑取产孢培养基上的小黑点，制作成水装临时切片，在Olympus光学显微镜下观察分生孢子器、分生孢子、子囊壳、子囊、子囊孢子颜色、形态，并测量其大小。
然后用LEICAICC50HD摄像显微镜进行拍照。
四、进程计划（各研究环节的时间安排、实施进度、完成程度等）
五、导师评语
青岛农业大学毕业（设计）教师指导记录表
学生姓名：
专业班级：
指导教师：
题目：
指导时间
指导内容
本表由学生根据教师指导情况进行真实记录，实习结束后，指导教师审核签字后交学院。
不够可加附页。
指导教师签字：
学生签字：
毕业（设计）中期检查表
学院
指导教师
学生姓名
专业年级
学号
题目
计划完成时间
工
作
进
展
情
况
检
查
及
意
见
检查人员签字：
备
注
毕业教师评阅表
姓名
专业班级
题目
评价项目
分值
得分
选题
质量
（25）
选题符合专业培养目标，体现综合训练基本要求
10
题目难易度和工作量大小
理论意义或实际价值
5
能力
水平
（35）
查阅中外文献资料的能力、外文运用能力
研究方案的设计与实施能力、研究方法和手段的运用能力
计算机的应用能力、试验或调查数据的分析与处理能力
综合运用知识能力、表述与撰写能力
（40）
文题相符、项目齐全、撰写质量高，无抄袭
格式规范，篇幅、数据、表格、参考文献等符合要求
中外文摘要通顺、高度概括凝练
成果的理论或实际价值
总评
100
评阅意见：
是否同意答辩：
评阅教师签字：
毕业答辩评定表
（15）
（20）
答辩
（30）
陈述内容紧扣主题、概念清楚、方法科学、数据可靠；
表述准确、思路清晰，有一定的应用价值。
报告准备充分，能够提供报告中必须的、完整的影像资料，试验数据，在规定的时间内作完报告。
答辩过程中能够运用掌握的知识准确、全面的回答答辩委员提出的问题。
答辩小组意见：
答辩教师签字：
教师评阅表（工程类）
设计
文题相符、项目齐全、无抄袭
格式规范，篇幅、数据、表格、插图（或图纸）、参考文献等符合要求
25
题目难易度和工作量大小、设计的实用性与科学性
设计说明书撰写水平、中外文摘要通顺、高度概括凝练
综合运用知识的能力、表述与撰写能力
方案的设计与实
升级会员 