实验设计方案马铃薯脱毒试管苗的快速繁殖和试管薯的诱导Word格式文档下载.docx
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实验1-3马铃薯试管苗的快速繁殖
利用适宜的培养基，诱导带有腋芽的马铃薯单节茎段进行芽生长和根再生形成单苗，从而达
到快速繁殖的目的。
实验1-4马铃薯试管薯诱导培养基的配制
实验1-5马铃薯试管薯的诱导
在培养马铃薯脱毒试管苗的培养容器中（试管苗培养4-6周），加入液体的马铃薯试管薯诱导培养基，置于全黑暗条件下即可诱导马铃薯试管苗结薯。
3．实验设备及材料
设备
冰箱、50ml三角瓶、500ml搪瓷杯、25ml量筒、1ml和5ml吸管、pH试纸（5.4~7.0）、封口膜、橡皮筋、扎口用棉线、药勺、称量纸、普通电子天平、移液管、量筒、烧杯、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、超净工作台等。
药品及试剂
MS基本培养基母液、马铃薯快速繁殖培养基、蒸馏水、75％酒精、蔗糖、琼脂、NAA、6-BA、水解酪蛋白、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、。
实验材料:
马铃薯脱毒苗
4．实验方法步骤及注意事项
方法步骤:
1-1MS培养基母液和常用试剂的配制
在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。
MS培养基母液包括大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。
可按照以下步骤配制为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存
4.1大量元素母液的配制
MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外可由KNO3、NH4NO3、CaCl2•2H20、MgSO4•7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
扩大
倍数
称取量/mg
母液定容
体积/ml
配1LMS培养基吸取量/ml
大量元素
KNO3
1900
20
38000
1000
50
NH4NO3
1650
33000
CaCl2•2H20
440
8800
MgSO4•7H2O
370
7400
KH2PO4
170
3400
4.2微量元素母液的配制
MS培养基中的微量元素可由MnSO4•4H2O、ZnSO4•7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4•2H2O、CuSO4•5H2O、CoCl2•6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见下表）。
成分
扩大倍数
配1L培养基吸取量/ml
微量元素
MnSO4•H2O
16.9
200
3380
1000
5
ZnSO4•7H2O
8.6
1720
H3BO3
6.2
1240
KI
0.83
166
Na2MoO4•2H2O
0.25
50
CuSO4•5H2O
0.025
CoCl2•6H2O
5
4.3分母液的配制
MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）
母液定容体积/ml
配1LMS吸取量/ml
有
机
成
分
甘氨酸
2.0
100
250
盐酸硫胺素
0.1
盐酸吡哆素
0.5
25
烟酸
肌醇
5000
▪
4.4铁盐母液的配制
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至5.8→定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。
用时每配lL培养基取该溶液5ml。
铁盐
Na2EDTA•2H2O
37.3
1865
FeSO4•7H2O
27.8
1390
4.5生长调节物质母液的配制
对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·
ml-1或ppm较为方便，一般配制成0.1-1mg·
ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。
2,4-D/NAA用少量95％酒精溶解，再加水定容；
6-BA应先溶于少量1mol·
L-1的HCl中，再加水定容。
母液种类
称取量（mg）
母液定容体积（ml）
母液浓度（mg/ml）
生长调节物质
2,4-D/NAA
6-苄氨基嘌呤
10
4.6用试剂的配制
盐酸（lmol·
L-1）：
用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制
氢氧化钠（lmol·
用固体氢氧化钠配制
75%酒精（v/v）：
用95%的酒精来配制
稀铬酸洗涤液：
重铬酸钾50g溶于1000ml蒸馏水中，冷却后缓慢加入工业用硫酸90ml。
1-2马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制
▪配方：
MS基本培养基＋0.7％琼脂＋3％蔗糖
▪配制体积：
每小组配制0.5L
（１）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（0.７～0.８％），撕碎后放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。
（２）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后加蒸馏水至所需体积。
（３）调节培养基的酸碱性至pH5.8:
培养基若偏酸时用lmol·
L-1NaOH来调节，偏碱则可用lmol·
L-1HCl来调节。
一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；
pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。
（４）培养基的分装:
占其容积的1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；
太少又会因营养不良影响生长。
培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。
（５）培养基的灭菌:
温度121℃时保持15～30min左右即可。
（6）接种工具准备:
分别取枪状镊子2把、眼科手术剪和手术刀各1把，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；
每套培养皿内放入合适滤纸2～3张，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；
然后和培养基一起统一灭菌。
1-3马铃薯试管苗的快速繁殖
▪
（1）准备工作:
①接种室的清洁和消毒
②超净工作台的开机和消毒
③剪刀、镊子、已灭菌培养皿、酒精棉球、酒精灯、待用培养基等的准备
④实验材料的准备
▪
（2）无菌操作
①实验操作前，操作人员洗手及手和小臂消毒（注意问题？
）
②使用的镊子、解剖刀等用95％酒精浸泡，之后放在酒精灯上灼烧灭菌，再放在灭菌后的培养皿中冷却后使用。
③培养瓶外壁的消毒
④将马铃薯试管苗剪为单节茎段后接种到培养基中，在植入材料的前后，培养瓶的瓶口须在酒精灯火焰上烧烤灭菌。
⑤封口、标记、将培养瓶置于培养架上，在温度20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12-14小时/天的条件下培养。
1-4马铃薯试管薯诱导培养基的配制
MS基本培养基＋3mg/L6-BA＋8％蔗糖
每小组配制0.5L，用100ml三角瓶分装成10瓶。
（1）药品及用具的准备
（2）培养基配制
（3）调节培养基的酸碱性至pH5.8
（4）培养基的分装
（5）培养基的灭菌
1-5马铃薯试管薯的诱导
（1）准备工作
a接种室的清洁和消毒；
b超净工作台的开机和消毒；
c剪刀、镊子、培养皿、待用培养基等的准备；
d实验材料的准备
（2）马铃薯试管薯的诱导方法
固体培养法、液体培养法、固液双层培养法，本次采用固体、液双层培养法。
（3）无菌操作
在无菌条件下将液体的马铃薯试管薯诱导培养基加入到用固体培养基培养马铃薯试管苗的容器中，置于黑暗条件下诱导马铃薯试管苗结薯。
注意事项:
①在配制MS培养基母液时，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。
力求
Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。
同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。
②配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。
最好在2～4℃的冰箱中保存,发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用
③培养基灭菌时注意:
▪1灭菌前检查锅内是否有足够的水；
▪2装锅不可过满；
▪3培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；
否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。
▪4当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。
切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。
5．实验结果:
⑴实验现象：
诱导共得到马铃薯微型薯3瓶，两瓶均无污染。
三瓶中的微型薯长势不错，但马铃薯苗出现轻微的倒伏现象。
第一瓶共有6株苗，第二瓶共有4株苗，第三共有5株苗，其中第一瓶中有6个微型薯（未拍摄），第二瓶中有微型薯4个（未拍摄），第三瓶中有微型薯4个（未拍摄）。
第一瓶中微型薯直径超过0.5厘米的有5个，第二瓶中微型薯直径超过0.5厘米的有3个。
微型薯呈现淡黄色，其中直径较大的颜色偏白，直径较小的颜色偏黄。
⑵实验现象分析：
两瓶中几乎所有的试管苗都产生了微型薯，产生的微型薯数量也较多，但直径超过0.5厘米的微型薯不多，究其原因可能是培养时间不够长。
另外，大部分马铃薯苗的叶子发黄，可能是长时间的培养后，培养基中的营养成分缺乏，也会造成微型薯营养不良。
6、参考文献：
[1]李浚明,朱登云编译.植物组织培养教程（第3版）.中国农业大学出版社,2005
[2]曹孜义,刘国民主编.实用植物组织培养技术教程.兰州：
甘肃科学技术出版社,2001
[3]张献龙,唐克轩主编.植物生物技术.北京：
科学出版社,2004
实验总结：
本次试验经历了较长时间，首先是单节茎段繁殖，在此操作过程中，将单节茎段的马铃薯苗植入单节茎段繁殖培养基的培养瓶后，要将瓶口对着火焰灭菌，在操作时一定要注意防止马铃薯苗被火焰烤死。
在操作时，我将瓶口小心翼翼地对着火焰灭菌，但其中一瓶幼苗还是受到了一定的伤害，出现了萎焉的情况。
后来观察幼苗生长情况时，虽然大部分幼苗的生长情况都很好，但部分幼苗的叶子发黄，估计与此有直接关系。
后面的液体振荡培养和微型薯诱导都很简单，最终得到了满意的微型薯。
实验的关键关键还是无菌操作，因为前面已经重复操做了很多次，所以本次实验没有一点污染。
本次试验最大的收获就是掌握了马铃薯快繁的技术。
植物组织培养在生产实践上有重要的作用，也许这门技术会在今后对我有很大的帮助。
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