常见猪病检测方法文档格式.docx
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VP
枸橼酸盐
鉴定
+
-
典型大肠埃希氏杆菌
非典型大肠埃希氏杆菌
典型柠檬酸盐杆菌
非典型柠檬酸盐杆菌
典型产气杆菌
非典型产气杆菌
出现表1的生化反响类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌。
如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验。
3.4致病性试验
a）取经营养肉汤37℃培养16~18h后的纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重20g左右的小白鼠，每株接种2~3只，每只〔含菌量约为1×
1012cfu／mL〕，同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。
b）饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。
在24小时内出现死亡的可报告为致病性大肠杆菌。
4药敏试验
a）挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，37℃培养16~18h，菌液用于药敏试验。
b）将肉汤培养物〔用标准比浊管比拟达相同浊度〕稀释至含菌量为1×
109cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5张，置37℃培养24ｈ后观察。
c）根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。
二、沙门氏菌的检测
参考NY/T550-2002〔动物和动物产品沙门氏菌检测方法〕。
适用于猪沙门氏菌病的诊断。
3.1.4赖氨酸脱羧酶〔LD〕
3.1.5邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷〔DNPG〕
3.1.6甘露醇糖发酵管
a）采集疑似病例的肝、脾、心血或肠内容物样品。
b）无菌剪取肝、脾样品1g，投入10mLSC增菌液中〔血液、粪便样品可以采适量直接投入10mL增菌液〕，36±
1℃培养18~24h。
c）取一接种环增菌液划线接种于DHL琼脂平板上，36±
观察平板上菌落生长形态。
沙门氏菌在DHL平板上呈无色半透明，产硫化氢〔H2S〕，菌落中心黑色或几乎全黑色。
a）挑取DHL平板上可疑菌落3~5个，每个菌落先洗入TSI培养基冷凝水中，继而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。
b）再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱羧酶发酵试验〔LD〕和ONPG，甘露醇糖
发酵管三支生化管，假设菌落偏小，二次挑取菌落有困难，可用接种环醮取TSI培养基中冷凝水接种其余生化管，36±
1℃培养18~24h〔挑取菌落后的平板，应置于4℃冰箱保存48h以备复查〕。
c）按表1记录反响结果，对照表2进行判定。
d）凡符合表2生化反响模式，可报告为沙门氏菌。
表1生化反响结果判定
生化管
TSI
LD
ONPG
MAN
底a
斜面b
硫化氢
第一次颜色
黄
黑
紫
深黄
记录符合
第二次颜色
红
无黑色
无色或淡
记录符号
a“底〞观察葡萄糖反响。
b“斜面〞观察乳糖和蔗糖反响。
表2生化检测沙门氏菌属判定表
序
ONP
斜
判定
号
底
G
面
A
沙门氏菌亚种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ
沙门氏菌亚种Ⅲb、15％Ⅲa
Ba
沙门氏菌亚种Ⅲa、Ⅴ、15％Ⅲb、
C
15％Ⅱ
Db
Ec
少数沙门氏菌亚种Ⅰ
Fd
甲型副伤寒沙门氏菌
+-
非沙门氏菌
a含1％硫化氢阳性的大肠埃希氏菌，可加试靛基质加以鉴别，其中大肠杆菌阳性，沙门氏菌阴性。
b赖氨酸阴性的沙门氏菌主要有：
甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种、鸡等。
c硫化氢阴性的沙门氏菌主要有：
甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱、猪伤寒、仙台、贝塔、巴布亚、鸡、马流产、山夫登堡、都柏林登。
。
d可直接用〔O〕单因子血清证实，以排除雷极氏普罗菲登斯菌登。
a）挑选DHL平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，36±
1℃培养16~18h，菌液用于药敏试验。
109cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴
附其上，每纸片2~5张，置36±
1℃培养24ｈ后观察。
三、产气荚膜梭菌的检测
1引用标准自定标准。
适用于猪产气荚膜梭菌病的诊断。
3材料
3.1绵羊血琼脂
3.2牛乳培养基。
4组织染色镜检
对疑似病例的肠道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直杆状，两端钝圆，单在或成双，无鞭毛，不运动。
芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，多数菌株可形成荚膜。
5别离培养
可将肠道内容物接种血平板，37℃厌氧培养18～24h后观察。
菌落特点：
魏氏梭菌在血平板上可形成直径2～5mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、外表光滑半透明、圆屋顶状菌落，有双层溶血环。
可通过镜检对形态进一步确定。
6生化鉴定
对牛乳培养基的“暴烈发酵〞。
7肠内毒素检查
采集空肠后段或结肠前段内容物，加适量生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分
成两份，一份加热〔60℃30min〕。
两份上清液分别静脉注射家兔〔1～3ml〕或小鼠〔～〕。
如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡，而加热组动物不死亡。
8报告
因为正常人畜肠道内存在此菌，并且发病菌主要靠在肠道内产生毒素致病，细菌本身并不侵入机体。
因此只有细菌别离和肠毒素检查都符合，并结合临床病症才能报告产气荚膜梭菌感染。
鉴别A型和C型要靠中和保护试验。
四、猪痢疾诊断
参考NY/T545-2002。
适用于猪痢疾〔SD〕的实验室诊断。
3粪便中Sh显微镜检查
3.1.1器材：
显微镜，暗视野镜头，玻片及盖玻片，酒精灯等
3.1.2染色液：
结晶紫染色液或稀释的石炭酸复红。
3.1.3样品：
病猪新鲜粪便〔含粘〕或直肠拭子或大肠内容物及黏膜
3.2操作方法
3.2.1min~3min，水洗，吸干后待检。
3.2.3悬滴样品制作：
取样品少许悬于生理盐水，待检。
每份样品最少制片2张
3.2.4显微镜检查：
染色样品以油镜直接观察，悬滴样品在暗视野400~1000倍镜头下观
察。
3.3结果判定
典型Sh菌体长6μμm，呈2~5个密螺旋体，两端锋利，呈蛇样活泼运动。
当视野中有数量〔3~5条以上〕Sh样菌体时，在获培养前，可作为诊断的重要参考。
4别离培养和鉴定
4.1材料准备
4.1.1器材：
厌氧培养装置及使用方法，细菌学实验常规器材，外科手术器材，微孔滤器
和μm滤膜。
4.1.2试验动物：
小鼠〔20g左右〕
4.1.3试剂：
，pH7.2），生理盐水，多粘菌素，TSA。
4.1.4样品：
病猪新鲜粪便或大肠粘膜刮取物〔含粘液〕。
对死猪或扑杀猪大肠分段结扎
〔每段10cm〕，别离取出。
样品应尽早别离培养，也可0～4℃保存4～7d。
4.2操作方法
4.2.1样品种Sh镜检
将样品少许摸片染色或作成悬滴标本，镜检，观察Sh有无活力。
含菌量少且无活力者，
那么难以别离成功。
4.2.2别离培养
4.2.2.1直接划线别离法：
即取样品直接在TSA上划线接种假设干皿。
4.2.2.2集菌法：
先将样品以生理盐水或PBS作1：
5稀释，2000r/min，弃去沉淀。
将上
清液再以6000～8000r/min离心20min。
取沉淀划线接种TSA假设干皿。
稀释法：
将样品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀释至
10-6～10-8。
取各梯度稀释
液各1
滴，分别划线接种于TSA上，〔每梯度稀释液最少接种
3皿〕。
接种后的培养
皿置厌氧罐内进行厌氧培养。
假设上述稀释液中参加多粘菌素200U/mL～300U/mL，可提
高别离率。
4.3结果判定
4.3.1观察
每隔2～4d开罐检查一次，共2～4次，观察有无溶血区及溶血菌落。
致病性Sh呈强β溶血，一般看不见菌落。
当培养条件适宜时，再溶血区可见到云
雾状菌苔。
无害蛇样螺旋体等呈弱β溶血。
4.3.2移植纯化
先作溶血区内物质涂片，染色镜检。
如见Sh样菌体，可在无菌落溶血区内移取小
块琼脂划线于TSA假设干皿。
如此每隔2天移植一次，一般2~4次后即可纯化和保存。
4.3.3猪蛇样螺旋体鉴定
4.3.3.1溶血试验
将猪蛇样螺旋体、无害蛇样螺旋体或毛肠蛇样螺旋体及被检菌株，分别划线于同一
TSA上不同区内，经48h培养后，观察比拟其溶血程度。
4.3.3.2肠致病性试验
每菌株至少接种6只小鼠，将小鼠停饲24h后，每只每次灌服1mL〔含菌3～5亿〕，次日再灌服一次，15d后剖检观察盲肠病变。
感染后50％出现腹泻和病变者，那么为致病
性Sh。
五、猪巴氏杆菌病诊断技术
参考NY/T564-2002。
适用于猪巴氏杆菌病的检测。
3.1改进马丁氏琼脂
3.2马丁氏肉汤
3.3常用生化培养基。
用肝脏组织或心血摸片或纯培养物染色呈阴性，瑞氏染色呈两极浓染的球杆菌。
5病原别离鉴定
将濒死前或死后数小时内以无菌手术采取病死猪的心血、肝脏组织，接种于改进马
丁氏琼脂斜面，进行别离。
培养18～24h后，改进马丁琼脂斜面生长纯粹的培养物，呈微蓝色菌台或菌落。
马丁肉汤培养物生长为均匀浑浊，不产生菌膜。
本菌发酵葡萄糖、果糖、半乳糖，多数发酵蔗糖，不发酵乳糖、肌醇、菊糖、水杨
素及鼠李糖，吲哚试验和氧化酶试验阳性。
7诊断判定
根据临床病症和病理变化，加上涂片染色镜检，可对本病作出初步的诊断，但确
诊要靠病原别离鉴定。
六、猪链球菌病诊断技术
参考GB/T19915.2-2005和
适用于猪链球菌病诊断。
对最急性和急性病例，无菌采取集病死猪的心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织做
触片，姬姆萨染色，链球菌可见较纯的单个或成双的圆形或椭圆形球菌,有少量形成短链和长链，如见链球菌那么说明病料中可能含有链球菌。
无菌取心、肝、脾、肺、肾或淋巴结内部组织划线接种普通琼脂绵羊血平板，36±
1℃培养24±
2h，如果菌落生长缓慢，可延长至48±
2h后观察。
如果是猪链球菌2型，培养24h，在普通琼脂绵羊血平板形成圆形、微凸、外表光
滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径0.3mm～1mm，大多数菌株呈α溶血，部
分菌株产生β溶血。
将可疑菌落做革兰氏染色和过氧化氢酶试验。
本菌为革兰氏阳性球菌，菌体直径μ
l固体培养物以双球菌为多，少量呈3个～5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无
芽孢，能形成荚膜。
本菌过氧化氢酶试验均为阴性。
菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢试验符合者，可初步确定为链球
菌。
经初步鉴定后，做5％乳糖、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试
验。
7PCR鉴定是否为猪链球菌2型
必要时进行猪链球菌2型毒力因子PCR检测。
7.1仪器：
台式高速〔12000r/min〕离心机；
DNA扩增仪；
水浴锅；
稳压稳流电泳仪和
水平电泳槽；
电泳凝胶成相分析系统；
可调移液器一套，包括1～20μL2支，20～200
μL1支，200～1000μL1支；
与移液器匹配的滴头；
1.5mL离心管；
0.5mL或〔与扩增仪配套〕塑料管。
7.2试剂
7.2.1细菌DNA提取试剂盒
×
PCRBuffer
2
7.2.510pmol/L引物
7.2.6TaqDNA聚合酶
TAE〔保存液〕和1×
TAE〔使用液〕
7.2.8琼脂糖：
电泳级
7.3PCR引物
根据猪链球菌2型溶血素基因设计引物，引物序列如下，其目的片断长度为495bp。
sly1：
5’-CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA-3’（1542）
sly2：
5’-GAAGATTGCGAGCATTTCCTG-3’（2036）
7.4DNA提取
利用对数生长期的液体培养物，严格按照DNA提取试剂盒说明书进行。
7.5PCR扩增
反响体系25μL：
细菌总DNA5.0μL
10pmol/μL的上游引物μL
10pmol/μL的下游引物μL
混合物μL
10×
μL
25mmol/L的MgCl2μL
5U的TaqDNA聚合酶μL
双蒸水补至25μL。
循环参数：
95℃预变性5min；
94℃变性1min；
56℃退火1min；
共35个循环，
72℃延伸1min；
72℃延伸10min，4℃保存。
7.6电泳检测
取1.5g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，制胶。
在电泳槽中参加电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。
取8～10μlPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液和
CYBgreen混合后加样，进行电泳。
电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm～5V/cm，电泳时间为30min～35min。
将电泳好的凝胶放紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果。
阳性对照的PCR产物电泳后在495bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR
产物电泳后没有条带，试验结果成立。
在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在495bp的位置上出现一条特异性条带，判为该菌株含有猪链球菌2型溶血素基因。
七、副猪嗜血杆菌〔Hps〕PCR诊断技术
自定标准。
副猪嗜血杆菌诊断。
3.1仪器：
3.2试剂
3.2.1TSA培养基
3.2.2TSB培养基
溶液中
3.2.4溶菌buffer（0.0005%Tween20，和，pH8.5）
引物
LoadingBuffer
琼脂糖
CYBgreen
4操作方法
4.1镜检
对从临床病症疑似副猪嗜血杆菌病的发病仔猪的肺和脾作组织触片，革兰氏染色，
副猪嗜血杆菌镜检呈革兰氏阴性小球杆菌。
4.2别离培养
取出患病仔猪病变肺、气管分泌物、胸水、腹水及脾组织，划线接种于TSA平板。
37℃，5%CO2培养24～48ｈ。
副猪嗜血杆菌呈无色、透明、湿润、光滑的露珠样细小
菌落，革兰氏染色呈阴性小球杆菌，老龄培养物呈多形态（细小杆状、短链状和长丝状）。
4.3PCR引物设计
HP16S1：
5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′
HP16S2：
5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′
该引物扩增出编码16SrRNA的DNA局部片段，长度为822bp。
tbpA55：
5′-TTAGCCTTGCTCTTCTTAGCC-3′
tbpA33：
5′-AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA-3′
该引物扩增出编码转铁结合蛋白A的DNA局部片段，长度为。
4.4细菌DNA提取
将TSA平板上典型菌落接种TSB，37℃过夜培养，取对数生长期别离菌悬浮于10mmol/LTris/1mmol/LEDTA溶液中，10000r/min离心5min；
弃上清，沉淀用溶菌buffer重悬；
56℃作用30min；
最后煮沸15min；
12000r/min离心5min；
收集上清，-20℃保存
备用。
注：
DNA的提取可以用试剂盒，按试剂盒操作说明进行，以节省时间，减少DNA
损失。
4.5编码16SrRNA的DNA局部片段的扩增
细菌总DNA2.0μL
10pmol/μL的上游引物μL
10pmol/μL的下游引物μL
无Mg2+缓冲液μL
94℃变性30s；
59℃退火30s；
共30个循环，
72℃延伸90s；
72℃延伸10min。
4.6编码tbpA的DNA局部片段的扩增
反响体系同，循环参数为：
94℃预变性5min;
50℃退火1min；
共30个循环
72℃延伸2min；
最后72℃延伸10min。
4.7结果分析与判定
％琼脂糖凝胶板的制备
称取1g琼脂糖，参加100mL1×
TAE中，加热融化后，倒入放置在水平台面上的
凝胶盘中，胶板厚5mm左右。
依据样品数选用适宜的梳子。
待凝胶冷却凝固后拔出梳
子〔胶中形成加样空〕，放入电泳槽中，加1×
TAE缓冲液淹没胶面。
4.7.2加样
取6～8μLPCR扩增产物和2～3μL加样缓冲液和适量CYBgreen混匀后参加一个加样孔。
每次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物作为对照，没有阳性对照的情况下，一定加Marker。
4.7.3电泳
电压80～100V，或电流40～50mA，电泳30～40min。
4.8.4结果观察与判定
电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上，翻开紫外灯观察。
如某一待检样品扩
增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上，即他们与加样孔的距离相同，或根据
Marker判定大小与设计的大小〔820bp和〕一致，那么该样品判定为阳性。
5诊断判定
同份样品在2个PCR中全部阳性的才可以判为本猪〔群〕已经感染Hps，根据流行
病学、临床病症和病理变化判定猪群是否发病。
八、猪繁殖与呼吸综合征〔PRRS〕PCR检测技术
适用于PRRS的PCR诊断。
组织匀浆机；
低温台式高速〔12000r/min〕离心机；
稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；
可调移液器一套，包括1～20
μL2支，20～200μL1支，200～1000μL1支；
3.2.1Trizol试剂
3.2.2氯仿
3.2.3异丙醇
3.2.4反转录酶M-MLV〔200U/μL〕
3.3.575%乙醇
3.2.60.1%焦碳酸二乙酯〔DEPC〕水溶液
10pmol/L引物
50×
TAE〔使用液〕
Oligo（dT）18〔50μmol/L〕
4操作步骤
4.1样品采集
取疑似猪的肺脏、淋巴结和脾脏病变部位组织，-20℃保存备用。
4.2样品处理
取局部组织样品，磨碎并用〔〕稀释成1:
5乳剂〔或将病料用剪刀剪成小块，放入5mL青霉素小瓶，进一步剪碎，按5倍体积的0.01MPBS后，用匀浆机匀浆〕，-20℃保存备用或立即用于RNA提取。
4.3RNA的提取
a）取处理好的稀释样品200~300μL，参加700μLTRIZOL试剂，涡悬混匀，在15~30℃温育2~3min；
参加200μL的氯仿，盖紧管盖，上下颠倒混匀15s，15~30
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