寄生虫实验诊断方法文档格式.docx

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直接涂片法:

用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。

方法简便，适用范围广，但检出率相对较低。

一般要求连续作3次涂片，可提高检出率。

⑴蠕虫卵检查：

方法：

一般在低倍镜下检查，如用高倍镜观察，需加盖片。

应注意虫卵与粪便中异物的鉴别。

虫卵都具有一定形状和大小；

卵壳表面光滑整齐，具固有色泽；

卵内含卵细胞或幼虫。

⑵原虫检查：

1）活滋养体检查：

方法同查蠕虫卵。

注意事项。

2）包囊的碘液染色检查：

方法同上，以一滴碘液代替生理盐水。

若同时需检查活滋养体，可在用生理盐水涂匀的粪滴附近滴一滴碘液，再盖上盖片。

涂片染色的一半查包囊；

末染色的一半查活滋养体。

3）隐孢子虫卵囊染色检查：

目前较佳的方法为金胺酚改良抗酸染色法。

对于新鲜粪便或经10％福尔马林固定保存的含卵囊粪便都可用此法染色。

染色过程是先用金胺－酚染色，再用改良抗酸染色法复染。

厚涂片透明法（改良加藤法）取约5mg粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油－孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便铺开（20×

25mm）。

待粪膜稍干，即可镜检。

玻璃纸准备：

将玻璃纸浸于甘油－孔雀绿溶液中，至少浸泡24小时，至玻璃纸呈现绿色。

使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间。

如粪膜厚，透明时间短，虫卵难以发现；

如透明时间过长，则虫卵变形，也不易辨认。

沉淀法：

原虫包囊和蠕虫卵的比重大可沉集于水底，有助于提高检出率。

但比重较小的钩虫卵和某些原虫包囊则效果较差。

方法：

自然沉淀法；

离心沉淀法；

醛醚沉淀法；

自然沉淀法：

取粪便20～30g、加水成混悬液，经金属筛过滤，再加清水冲洗残渣；

过滤粪液在容器中静置25分钟，倒去上液，重新加满清水，以后每隔15～20分钟换水一次（3～4次），直至上液清晰为止。

最后倒去上液，取沉渣作涂片镜检。

离心沉淀法：

将上述滤去粗渣的粪液离心（1500～2000rpm/min）1～2分钟，倒去上液，注入清水，再离心沉淀，如此反复沉淀3～4次，直至上液澄清为止，最后倒去上液，取沉渣镜检。

醛醚沉淀法：

置粪便1～2g加水10～20ml调匀，将粪便混悬液过滤，离心（2000rpm）2分钟；

倒去上层粪液，加水10ml混匀，离心2分钟；

倒去上液，加10％甲醛7ml。

5分钟后加乙醚3ml，塞紧管口并充分摇匀，取下管口塞，离心2分钟，即可见管内自下而上分为4层。

取管底沉渣涂片镜检。

如检查原虫包囊，可加卢戈氏液染色，加盖片镜检。

浮聚法：

利用比重较大的液体，使原虫包囊或蠕虫卵上浮，集中于液体表面。

常用的方法有三种：

1.饱和盐水浮聚法；

2.硫酸锌离心浮聚法；

3.蔗糖离心浮聚法

饱和盐水浮聚法：

此法用以检查钩虫卵效果最好。

方法、优缺点、适用范围。

饱和盐水配制：

将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内，不断搅动，直至食盐不再溶解为止

硫酸锌离心浮聚法：

此法可用于检查原虫包囊，球虫卵囊和蠕虫卵。

取粪便约1g，加水充分搅碎，按离心沉淀法过滤，反复离心3～4次，至水清为止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸锌液（33％的溶液），调匀后再加硫酸锌溶液至距管口约1cm处，离心1分钟。

用金属环取表面的粪液置于载玻片上，加碘液一滴，镜检。

蔗糖离心浮聚法：

此法适用于检查粪便中隐孢子虫的卵囊。

取粪便约加水并过滤。

取滤液离心5～10分钟，吸弃上清液，加蔗糖溶液再离心，然后如同饱和盐水浮聚法，取其表液膜镜检（高倍或油镜）。

卵囊透明无色，隐孢子虫的卵囊在漂浮液中浮力较大，常紧贴于盖片之下，但1小时后卵囊脱水变形不易辨认，故应立即镜检。

也可用饱和硫酸锌溶液或饱和盐水替代蔗糖溶液。

毛蚴孵化法　取粪便约30g，先经重力沉淀法浓集处理,将粪便沉渣倒入三角烧瓶内，加清水（去氯水）至瓶口,在20～30℃的条件下经4～6小时后肉眼或放大镜观察结果。

如见水面下有白色点状物作直线来往游动，即是毛蚴。

肛门拭子检查法　适用于在肛周产卵（蛲虫），或常在肛门附近发现虫卵（牛带绦虫）的虫卵检查法。

棉签拭子法：

用浸泡生理盐水的棉签，在肛门周围擦拭，随后将棉签放入盛有饱和盐水的试管中，用力搅动，迅速提起棉签并弃去，再加饱和盐水至管口处，覆盖一载玻片，5分钟后取载玻片镜检。

也可将擦拭肛周的棉签放在盛清水的试管中，经充分浸泡，取出，弃去。

试管静置10分钟，或经离心后，倒去上液，取沉渣镜检。

透明胶纸法：

用长约6cm，宽约2cm的透明胶纸粘擦肛门周围的皮肤，取下胶纸，将有胶面平贴玻片上，镜检。

钩蚴培养法：

根据钩虫卵在适宜条件下可在短时间内孵出幼虫的原理设计的方法。

虫卵计数法:

虫卵计数用于估计人体内寄生虫的感染度，常用司徒尔（Stoll）氏法，即司氏稀释虫卵计数法

定量透明法　适用于各种粪便内蠕虫卵的检查及计数。

将所得虫卵数×

24，再乘上述粪便性状系数，即为每克粪便虫卵数（eggs　per　gram，EPG）。

（二）血清检查：

是诊断疟疾、丝虫病的基本方法。

涂制血膜用的载玻片用前需经洗涤液处理，自来水、蒸馏水冲洗，在95％酒精中浸泡，擦干或烤干后使用。

厚薄血膜同片制作:

检查疟原虫。

操作步骤、优缺点

检查微丝蚴

　　⑴新鲜血片检查：

晚间9时至次晨2时取血1滴滴于载玻片上，加盖片，在低倍镜下观察，发现蛇形游动的幼虫后，仍须作染色检查，以确定虫种。

　　⑵厚血膜检查：

厚血膜的制作、溶血、固定与姬氏液染色同疟原虫。

但需取血3滴，也可用苏木素染色法染色。

（三）排泄物与分泌物等的检查

痰液　痰中可能查见肺吸虫卵、溶组织内阿米巴滋养体、棘球蚴的原头蚴、粪类圆线虫幼虫、蛔蚴、钩蚴、尘螨等；

卡氏肺孢子虫的包囊也可出现于痰中，但检出率很低。

肺吸虫卵检查：

浓集法

直接涂片法：

在洁净载玻片上先加1～2滴生理盐水，挑取痰液少许，最好选带铁锈色的痰，涂成痰膜，加盖片镜检。

如未发现肺吸虫卵，但见有夏科－雷登晶体，提示可能是肺吸虫患者。

浓集法：

收集24小时痰液，置于玻璃杯中，加入等量10％NaOH溶液，使痰液消化成稀液状。

以1500rpm离心5～10分钟，弃去上清液，取沉渣滴涂片检查。

溶组织内阿米巴大滋养体检查：

取新鲜痰液作涂片。

天冷时应注意镜台载玻片保温。

高倍镜观察。

如为阿米巴滋养体，可见其伸出伪足并作定向运动。

十二指肠液和胆汁　用十二指肠引流管抽取十二指肠液及胆汁，以直接涂片法镜检；

也可经离心浓集后，吸取沉渣镜检。

可检查蓝氏贾第鞭毛虫滋养体、华支睾吸虫卵、肝片形吸血卵和布氏姜片虫卵等；

急性阿米巴肝脓肿患者偶在胆汁中发现大滋养体。

尿　一般先离心，后取沉渣镜检。

但乳糜尿需加等量乙醚，用力振荡，使脂肪溶于乙醚。

然后吸去脂肪层，离心，取沉渣镜检。

鞘膜积液　主要检查班氏微丝蚴。

阴囊皮肤经碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜积液作直接涂片检查，也可加适量生理盐水稀释离心，取沉渣镜检。

阴道分泌物　检查阴道毛滴虫

其它器官组织检查

1．骨髓穿刺　主要检查杜氏利什曼原虫无鞭毛体。

一般常作髂骨穿刺，取少许骨髓液作涂片；

甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油镜检

淋巴结穿刺

⑴利什曼原虫：

检出率低于骨髓穿刺，但方法简便、安全，且有一定疗效考核价值。

淋巴结组织液注于载玻片上，作涂片染色检查。

也可用摘除的淋巴结的切面做涂片，染色后镜检。

⑵丝虫成虫：

可用注射器从可疑的淋巴结节中抽取成虫，或剖检摘除的结节寻找成虫，也可作病理组织切片检查。

肌肉活检

⑴旋毛虫幼虫从患者的腓肠肌或肱或股二头肌取米粒大小的肌肉一块，置于载玻片上，加50％甘油滴，盖上另一载玻片，均匀用力压紧，低倍镜下观察。

取下肌肉须立即检查，否则幼虫变得模糊，不易检查。

⑵猪囊尾蚴：

摘取肌肉内的结节，剥除外层纤维被膜，在2张载玻片间压平、镜检。

也可经组织固定后作切片染色检查。

皮肤：

检查疥螨，蠕形螨，利什曼原虫等。

　⑴疥螨：

　⑵蠕形螨：

　⑶利什曼原虫：

直肠粘膜：

用直肠镜从直肠粘膜病变组织内可查见日本血吸虫卵及溶组织阿米巴滋养体。

日本血吸虫卵：

用直肠镜自直肠取米粒大小的粘膜一块，经水洗后，放在2载玻片间，轻轻压平，镜检

溶组织阿米巴：

用乙状结肠镜观察溃疡形状，自溃疡边缘或深层刮取溃疡组织，置于载玻片上，加少量生理盐水，盖上盖片，轻轻压平，立即镜检。

也可取出一小块病变的粘膜组织，固定切片，染色检查。

免疫学诊断

环卵沉淀试验（COPT）是以血吸虫整卵为抗原的特异免疫血清学试验

原理：

卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出与检测血清内的特异抗体结合，可在虫卵周围形成特殊的复合物沉淀，在光镜下判读反应强度并计数反应卵的百分率称环沉率。

塑料管法COPT:

双面胶纸法COPT:

PVF抗原膜片法:

血凝板法:

组织内环卵沉淀反应:

酶联环卵沉淀反应

方法评价:

COPT可作为诊断血吸虫病的血清学方法之一，及临床治疗病人的依据；

可用作考核治疗和防治效果的方法；

并且用于血清流行病学调查及监测疫情的方法。

皮内试验：

利用宿主的速发型变态反应，将特异抗原液注入皮内，观测皮丘及红晕反应以判断有无特异抗体（IgE）的存在称皮内试验（IDT）。

方法:

取皮试液0.1ml作皮内注射，20min后判断皮试结果。

结果判断标准：

阴性：

局部无红肿、无异常全身反应。

阳性：

皮丘红肿，硬结直径大于1.5cm，红晕范围直径超过4cm，有时出现伪足或有痒感.

皮内试验用于多种寄生虫病的检测，如血吸虫病、肺吸虫病等。

最常用于血吸虫病的调查。

操作简单，并且可即时观察结果，适宜现场应用。

大多用粗制可溶性血吸虫虫卵抗原（稀释度为1：

4000）或成虫冷浸抗原（稀释度为1：

8000），其阳性率在93％～97％，但有部分假阳性反应（2.1％～3.5％），并且对其他寄生虫病交叉反应较高。

皮内试验的应用范围：

①过筛方法，先作皮试，阳性者再作进一步追查；

②临床辅助诊断；

③考核预防效果，用作检查新感染的方法，特别对儿童。

染色试验（DT）是比较独特的免疫反应，是目前诊断弓形虫病较好的方法，可用于该病的临床诊断和流行病学调查

新鲜活弓形虫滋养体胞质对碱性美蓝有很强的亲和性，能被染成蓝色；

但当弓形虫受特异性抗体和辅助因子协同作用后，细胞变性、细胞膜破裂，细胞质外溢，虫体不着色。

新鲜弓形虫滋养体和正常血清混合，在37℃作用1小时或室温数小时后，大部分弓形虫失去原来的新月形，而变为圆形或椭圆形，用碱性美蓝染色时着色很深。

但新鲜弓形虫和免疫血清混合时，虫体仍保持原有形态，用碱性美蓝染色时，着色很浅或不着色。

其原因可能是由于弓形虫受到特异体抗体和辅助因子协同作用后，虫体细胞变性，结果虫体对碱性美蓝不易着色。

将经56度30min灭活的待测血清同滋养体和辅助因子共同作用后加美蓝染色，如有50%或以上不着色者即为阳性。

可使50%虫体不着色的血清稀释度即为血清阳性滴度。

结果判断：

1：

8为隐性感染；

256为活动性感染；

1024为急性感染。

间接血凝试验（IHA）

以人O型红细胞或绵羊红细胞为载体，经特殊处理后结合上特异性抗原，即为致敏红细胞。

在遇到相应的抗体时发生特异性结合，致使红细胞产生交联而凝集成肉眼可见的团块，即为阳性。

如无特异性的抗体则红细胞不发生凝集而沉于底部，为阴性。

间接血凝抑制试验：

用已知抗原或抗体预先与待测标本作用，以中和相应的抗体或抗原，再加入相应的致敏红细胞，如无法交联而不发生凝集则为阳性。

根据红细胞在孔底的沉积类型而定。

“－”，红细胞沉于管底，呈圆点形，外周光滑；

“±

”，红细胞沉于管底，周围不光滑或中心有白色小点；

“＋”，红细胞沉积范围很小，呈较明显的环形圈

“＋＋”，红细胞沉积范围较小，其中可出现淡淡的环形圈；

“＋＋＋”，红细胞布满管底呈毛玻璃状；

“＋＋＋＋”，红细胞呈片状凝集或边缘卷曲。

呈明显阳性反应（＋）的最高稀释度为该血清的滴度或效价。

间接荧光抗体法（IFA）

将抗原与未标记的特异性抗体（如患者血清）结合，然后使之与荧光标记的抗免疫球蛋白抗体（抗抗体）结合，三者的复合物可发出荧光。

本法的优点是制备一种荧光标记的抗体，可以用于多种抗原，抗体系统的检查，即可用以测定抗原，也可用来测定抗体。

IFA的抗原可用虫体或含虫体的组织切片或涂片，经充分干燥后低温长期保存备用。

一张载片可等距置放多个抗原位点用以同时检测多个样本或确定滴度。

酶联免疫吸附试验（ELISA）简称酶联试验，已广泛用于多种寄生虫感染的宿主体液以及排泄分泌物（尿，乳，粪便等）内特异抗体或抗原微粒的检测。

根据检测要求，试验可分多种类型，常用者有：

用于检测抗体的间接法；

检测IgM的双夹心法；

检测抗原的双抗体夹心法；

以固相抗体检测抗原的竞争法以及竞争抑制法等。

酶联试验的方法根据所用载体、酶底物系统、观察反应结果等不同而有很大差别。

目前最常用的固相载体为聚苯乙稀微量滴定板，具有需样少，敏感，重演性好，使用方便等优点。

酶底物系统也有多种，常用的有辣根过氧化物酶－邻苯二胺（HRP－OPD）、碱性磷酸酯酶－硝酚磷酸盐（AKP－PNP）等，具有较好的生物放大效应。

其中HRP由于价廉、易得而被广泛应用。

酶联试验的基本操作过程可分为：

①固相包被；

②温育洗涤；

③加样；

④酶结合物反应；

⑤底物显色；

⑥终止反应读取结果等若干步骤。

温育和洗涤需贯穿在每二步骤之间，用以去除多余的反应物。

斑点ELISA（dot-ELISA）是近年新发展的一种ELISA技术，选用对蛋白质有很强吸附能力的硝酸纤维素薄膜作固相载体，底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色，然后目测或用光密度扫描仪定量。

dot-ELISA可用来检测抗体，也可用来检测抗原，由于该法检测抗原时操作较其他免疫学试验简便，故目前多用于抗原检测。

免疫印渍试验是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），电泳转印及标记免疫试验三项技术结合而成的一种新型的免疫探针技术，是用于分析蛋白抗原和鉴别生物学活性抗原组分的有效方法，近年已应用于检测寄生虫感染宿主体液内针对某分子量抗原的相应循环抗体成分或谱型。

是为一项高敏感和高特异的诊断方法，具有很大发展潜力。

用于诊断的免疫印渍试验以采用酶标记的探针（即二抗及其标记结合物）为安全方便，称酶免疫转移印渍试验

DNA探针技术：

又称核酸分子杂交技术，最近几年迅速发展起来的一种敏感性高，特异性强，应用面广的研究手段。

在寄生虫病诊断中，探针是病原体的特异核酸序列，可用来检测出病原体是否存在，其关键环节在于获得特异的核酸探针。

DNA探针检测，其特异性和敏感性高；

并且DNA探针是直接检测寄生虫的基因，故比血清学方法可靠；

又因探针DNA较稳定，在合适条件下可较长期保存；

在试验条件不变时试验结果的重演性较好。

在寄生虫病的诊断、现场调查、寄生虫种的鉴定及分类等方面的研究中均已使用了DNA探针技术，内容包括原虫、吸虫、线虫、绦虫、昆虫的鉴定和致病的诊断。

PCR技术：

检测病原体遗传物质用以诊断寄生虫病的方法，除分子杂交技术外，新近发展的更灵敏、快速，并且不需要同位素标记的基因扩增技术，如聚合酶链反应（PCR）是一种体外扩增特异性DNA技术。

基本原理：

PCR是体外DNA的大量复制合成反应

其基本要素有：

DNA模板：

寡聚核苷酸；

耐热DNA聚合酶；

四种单核苷酸；

反应缓冲液

基本PCR；

RT-PCR，PCR-ELISA

（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）