杞菊地黄丸浓微生物限度验证.docx
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杞菊地黄丸浓微生物限度验证
微生物限度检查方法验证文件
产品名称
杞菊地黄丸（浓缩丸）
产品代号
C-006
编 码
WSW061200100
×××××药业有限公司
1 验证方案的制定、审核、批准
剂 型
产 品 名 称
丸剂
逍遥丸（浓缩丸）
验 证 小 组
成员职务
姓 名
主 要 职 责
组 长
验证负责人
副组长
方案及报告审核负责人
成 员
方案制度实施负责人
实施人
起草人
起草日期：
审核人
审核日期：
批准人
批准日期：
验证方案组织
实施进度
年 月 日至 年 月 日
2 目的
建立药品微生物检查法，确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。
3 微生物限度室的环境
本验证用无菌室光线良好、温湿度适中、远离厕所及污染区。
面积8平方米，高度2.2米。
由一更衣间、二更衣间、缓冲间、无菌室、阳性对照室组成。
无菌室、阳性对照室分别装有传递窗。
一更衣间内有洗手盆、防静电抹台面抹布、防静电抹地面抹布、0.15%新洁尔灭、吉祥牌干手器、多用途胶粘型除尘器、洁净工作鞋。
二更衣间有不锈钢挂钩，挂有防静电洁净工作服、口罩。
室内六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处呈凹弧形，无缝隙、无死角。
室内没有下水道。
墙壁、天花板采用耐腐蚀彩钢板材料，地面采用耐磨地板胶建成。
操作间有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级。
微生物限度室、阳性对照室分别放置100级超净工作台和温湿度表，装有柜式空调，室内温度控制18～26℃，相对湿度45～65%。
缓冲间及操作间内有空气消毒效果的紫外灯及臭氧消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间装有静压差计。
无菌室内的照明灯嵌装在天花板内，室内光照分布均匀，光照度不低于300lx。
更衣间、缓冲间、操作间和传递窗所设置的紫外线杀菌灯（2～2.5/m3），一个月定期检查辐射强度，要求在操作面上达40µW·cm－2。
无菌室一个月用丙二醇或甲醛交替熏蒸。
每周和每次操作前用0.15%洁尔灭消毒擦拭操作台及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌30分钟。
在每次操作完毕，同样用上述消毒液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。
无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。
无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30分钟，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35℃预培养48小时，结果无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）传入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30分钟后将盖盖上。
在30～35℃培养箱内倒置培养48小时，取出检查。
3个平板生长的平均菌落数不超过1个。
无菌操作台面或超净工作台一个请有关部门检测其悬浮粒子，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径≥0.5µm的粒数不得超过3.5个/升，≥5µm的粒数为0，空气流速应≥0.35µm/s，可根据无菌状况必要时置换过滤器。
均已验证合格。
4 主要设备仪器及器皿一览表
名 称
规 格
数 量
隔水培养箱
GH
1台
生化培养箱
PYX-190S-A
1台
数显恒温水浴锅
HH－2
1台
立式压力蒸汽灭菌器
YXQ－LS－50SI
1台
电热恒温干燥箱
WMK－02
1台
冰箱
BGD－180
1台
超净工作台
SW－CJ－2FD
2台
尘埃粒子计数器
CLJ－10D
1台
电子天平
LP1502（1500g/10mg）
1台
马头牌架盘药物天平
JYT－5
1台
吉祥自动干手器
JXG－130
1台
接种环
1支
电炉
1个
不锈钢锅
1个
酒精灯
2盏
75%酒精棉球
2瓶
脱脂棉
1袋
灭菌剪刀
1把
牛皮纸
灭菌镊子
2把
灭菌称样纸
1把
不锈钢药匙
1把
试管架
2个
打火机
2个
记号笔
2支
锥形瓶
100ml、500ml
5个、12个
培养皿
Φ90mm
140对
研钵
3个
量筒
500ml、100ml
各1个
试管
15ml、25ml
4支、17支
吸管
1ml、2ml分度0.01
25根
吸管
10ml分度0.1
15根
实验记录纸
1本
5 内容
5.1试液及其配制
0.15%新洁尔灭：
用500ml量筒倒入0.75ml新洁尔灭溶液，加水至500ml即得。
75%乙醇溶液：
用100ml量筒倒入75ml无水乙醇，加水至100ml即得。
3.2稀释剂和试剂
0.9%无菌氯化钠溶液200ml（分装10ml8试管、5ml12试管）：
取氯化钠1.8g，加水溶解使成200ml，过滤，分装、灭菌。
Ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml（分装锥形瓶100ml4瓶）：
取磷酸二氢钾1.78g、磷酸氢二钠3.62g、氯化钠2.15g、蛋白胨0.5g，加水500ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
稀释剂配制后，分装，置立式压力蒸汽灭菌器内灭菌。
灭菌温度121℃，时间15分钟。
5.2培养基及其配制
胆盐乳糖培养基800ml、0.1%蛋白胨水400ml、营养琼脂培养基2000ml、改良马丁培养基1500ml、虎红培养基500ml、5%乳糖发酵培养基（5ml×9只试管，阳性对照、阴性对照、供试品）。
根据各培养基瓶签上的配制方法，计算、配制、分装、灭菌。
5.3菌种及菌液制备
5.3.1菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性（从孝感市药品检验所购买的第二代菌种）。
大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501]
白色念株菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]
黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]
5.3.2菌种制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各接种在10ml营养琼脂试管中，培养18～24小时，培养温度30～35℃。
白色念珠菌、黑曲霉各接种在10ml改良马丁琼脂培养基试管中，培养24～48小时，培养温度23℃。
以上五种菌在斜面上生长的情况不是很好，必须先抚壮。
5.4菌种试培养皿
通过这一步，确定每一管各验证菌含菌是否为50～100cfu。
5.4.1培养皿的制备
将配制灭菌好的营养琼脂培养基冷却至43～45℃，每个培养皿倒入15～20ml，共倒42个培养皿。
将配制灭菌好的改良马丁培养基冷却至43～45℃，每个培养皿倒入15～20ml，共倒28个培养皿。
5.4.2取抚壮后的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉验证菌各1ml于装有9ml的0.9%无菌氯化钠稀释剂中，依次用10倍递增法进行稀释，于试管中各取0.1ml划线培养。
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各验证菌每个稀释级各划线二个营养琼脂制备的培养皿，培养温度37℃，培养时间18～24小时。
白色念珠菌、黑曲霉各验证菌每个稀释级各划线二个改良马丁琼脂制备的培养皿，培养温度23.7℃，培养时间24～48小时。
活菌计数结果（cfu/ml）
验 证 菌
10-4
10-5
10-6
10-7
大肠埃希菌
——
——
——
851
132
243
93
105
金黄色葡萄球菌
——
2367
493
542
102
116
97
90
枯草芽孢杆菌
——
——
886
——
110
98
101
108
白色念珠菌
——
——
421
395
91
99
88
92
黑曲霉
——
——
284
——
89
75
77
80
以上验证菌10-6、10-7符合50～100cfu菌，选其中一个稀释级即可（10-7）。
5.5试验准备
5.5.1将二个批号的供试品及所有已灭菌的供试品、平皿、锥形瓶、试管、吸管、稀释剂等经传递至无菌室内。
每次试验所用物品必须事行做好计划，准备足够用量，避免操作中出处无菌间。
编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
5.5.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置30分钟。
5.5.3关闭紫外杀灯后，操作人员用肥洗手，进入缓冲间，换工作鞋。
再用0.15新洁尔灭洗手，穿防静电无菌衣、口罩、手套。
5.5.4点燃酒精灯。
操作前用乙醇棉球擦手、操作台台面及扭力天平的托盘，再用乙醇棉球擦拭供试品袋的开口处周围，待干后用灭菌的手术剪将袋口的封口处剪开。
5.5.5将一个空白培养皿置操作台上、一个空白培养皿置无菌室角落里，各开盖20分钟，盖上盖，操作台上的一个培养皿倒入营养琼脂，作为台内空白对照；无菌室角落里倒入虎红琼脂，作为室内空白对照。
5.6供试液的制备
将天平调节平衡，分别将灭菌称样纸放置在天平的左右托盘内，调节10g游砝，用不锈钢药匙将供试品舀到天平的左托盘，称至10g。
将称好的供试品倒入灭菌研钵中，倒入100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液浸泡10分钟，上面用灭菌纸盖好。
再将浸泡好的供试液研碎，移入刚倒出100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液锥形中。
摇匀，静置。
5.7验证方法
验证试验分三组进行，每组平行试验，分别计算各试验菌每次试验的回收率。
（1）试验组：
1ml供试液+0.1ml菌液（含菌50～100cfu菌）
平皿法计数时，取最低稀释级供试液1ml和50～100cfu菌试验菌，分别注入平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
（2）菌液组：
0.1ml菌液（含菌50～100cfu菌）
取0.1ml菌液注入平皿中，平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。
（3）稀释剂对照组：
1mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液+0.1ml菌液（含菌50～100cfu菌）
取1mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和0.1ml菌液注入平皿中，平行制备2个平皿。
（4）供试品对照组：
取制备好的供试液1ml
供试液的释释（10倍递增稀释法）
从制备好的供试液取1ml至装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，反复吸吹10次，摇匀。
此试管为10-1。
用10ml吸管在10-1试管中吸取8ml注入8个培养皿内，3组细菌平行样，一组霉菌平行样。
再从10-1试管中取1ml至装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，反复吸吹10次，摇匀。
此试管为10-2。
用10ml吸管在10-2试管中吸取8ml注入8个培养皿内，3组细菌平行样，一组霉菌平行样。
再从10-2试管中取1ml至装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，反复吸吹10次，摇匀。
此试管为10-3。
用10ml吸管在10-3试管中吸取8ml注入8个培养皿内，3组细菌平行样，一组霉菌平行样。
将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及3组供试品平行样倒入营养琼脂培养基（每一培养皿15～20ml），待凝固。
将凝固的培养皿放入电热恒温培养箱中，培养24～48小时，培养温度32.4℃。
白色念珠菌、黑曲霉培养皿倒入改良马丁琼脂培养基（每一培养皿15～20ml），待凝固。
一组供试品平行样倒入虎红培养基（每一培养皿15～20ml），待凝固。
放入生化培养箱中，培养48～72小时，培养温度23.7℃。
5.8大肠菌群检查方法的验证
（1）供试品组：
分别取1:
10、1:
100、1:
1000的供试液1ml到装有10ml胆盐乳糖发酵管内。
（2）菌液组：
10ml胆盐乳糖发酵管内加入大肠埃希菌液0.1ml（50～100cfu菌）。
（3）稀释剂对照组：
取10ml胆盐乳糖发酵管1支，加入1mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
（4）试验组：
分别取1:
10、1:
100、1:
1000的供试液1ml到装有10ml胆盐乳糖发酵管内，再加入0.1ml大肠埃希菌液。
以上各组放入电热恒温培养箱中，培养18～24小时，培养温度37.4℃。
结论：
供试品组、稀释剂对照组胆盐乳糖发酵管不产酸产气，判各管未检出大肠菌群；菌液组、试验组胆盐乳糖发酵管产酸产气，判各管检出大肠菌群。
供试品未检出大肠菌群。
5.9控制菌检查方法的验证
（1）试验组：
取1:
10的供试液10ml到装有100ml胆盐乳糖增菌液的烧瓶中，加入0.1ml大肠埃希菌液（50～100cfu），摇匀。
（2）阴性菌对照组：
分别取二个批号制备好1:
10的供试液10ml到装有100ml胆盐乳糖增菌液的烧瓶中，加入0.1ml金黄色葡萄球菌液（50～100cfu）,摇匀。
以上各组放入电热恒温培养箱中，培养18～24小时，培养温度37.4℃。
结论：
试验组呈阳性，阴性对照组呈阴性判供试品未检出控制菌。
验证报告
药品名称：
杞菊地黄丸（浓缩丸）规格：
每8丸相当于原生药3克
批号：
060601060701061203产品生产单位：
湖北端药药业有限公司
金黄色葡萄球菌
（26003）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
菌液组
93
97
95
107
88
98
94
88
91
稀释剂对照组
96
85
91
103
112
108
93
99
96
试验组
98
104
101
104
94
99
102
105
104
大肠埃希菌
（44102）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
菌液组
101
107
104
101
108
105
108
96
102
稀释剂对照组
96
108
102
90
94
92
117
93
105
试验组
115
115
115
114
109
112
107
119
113
白色念珠菌
（98001）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
菌液组
106
100
103
91
99
95
92
102
97
稀释剂对照组
95
101
98
96
98
97
110
92
101
试验组
98
109
104
97
108
103
109
109
109
枯草芽孢杆菌
（63501）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
菌液组
70
70
70
74
75
75
73
71
72
稀释剂对照组
71
82
77
77
76
77
87
80
84
试验组
81
77
79
81
86
84
91
90
91
黑曲霉
（98003）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
菌液组
61
66
64
60
59
60
57
60
59
稀释剂对照组
66
68
67
73
62
68
68
68
68
试验组
75
77
76
74
72
73
84
80
82
供试品对照组
供试品060601（10-1）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
4
2
30
3
3
30
4
4
40
霉菌数
1
2
15
0
0
0
0
0
0
供试品对照组
（10-2）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
霉菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
供试品对照组
（10-3）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
霉菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
供试品对照组
供试品060701（10-1）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
霉菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
供试品对照组
（10-2）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
霉菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
供试品对照组
（10-3）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
霉菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
供试品对照组
供试品061203（10-1）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
2
1
15
4
0
20
2
4
30
霉菌数
2
2
20
0
0
0
0
0
0
供试品对照组
（10-2）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
霉菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
供试品对照组
（10-3）
第一组
第二组
第三组
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
一皿
二皿
平均
细菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
霉菌数
0
0
0
0
0
0
0
0
0
结果判断：
每种菌的回收率可按下式计算：
试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数
试验组的菌回收率（%）＝ ×100%
菌液组的平均菌落数
稀释剂对照组的平均菌落数
稀释剂对照组的菌回收率（%）＝ ×100%
菌液组的平均菌落数
杞菊地黄丸（浓缩丸）微生物限度检查法验证试验结果
验证菌
试验组的菌回收率（%）
稀释剂对照组的回收率（%）
第一组
第二组
第三组
第一组
第二组
第三组
金黄色葡萄球菌
75
70
70
96
110
105
大肠埃希菌
82
78
72
98
88
103
白色念珠菌
72
77
71
95
102
104
枯草芽孢杆菌
70
72
71
110
103
117
黑曲霉
72
72
71
105
113
115
结论：
从以上结果显示，试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率不低于70%。
杞菊地黄丸（浓缩丸）的微生物限度检查对微生物生长没有抑菌性影响。
因此，可采用10递增的方法验证。
审核人：
日期：
批准人：
日期：
升级会员 