欧洲药典EP60细菌内毒素 中文Word文档格式.docx
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内毒素以国际单位（IU）表示。
IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。
一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。
根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。
内毒素标准溶液的制备
充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。
得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。
供试品溶液的制备
除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。
某些成分或药品可能在其它的水溶液中溶解度更高。
如有必要，调节待测溶液（或它的稀释液）的pH值，使鲎试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选鲎试剂生产商的指定pH范围内。
一般要求供试品溶液的pH值范围为6.0——8.0。
可用鲎试剂生产商推荐的酸、碱或适当的缓冲溶液来调解pH值。
酸或碱溶液须用BET检查用水在去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
确定最大有效稀释倍数
最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。
MVD按下列公式确定：
MVD=内毒素限值×
供试品溶液浓度/λ
内毒素限值：
在剂量的基础上，注射药物的活性成分的内毒素限度为
K/M
K=人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量（EU/kg）
M＝人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。
专论中，注射剂的活性成分的内毒素限度的单位有IU/ml、IU/mg、IU/生物活性单位等。
供试品溶液的浓度表示法：
－当内毒素限度以质量（IU/mg）表示时，用mg/ml表示浓度。
-当内毒素限度以（IU/ml）表示时，用ml/ml表示浓度。
-当内毒素限度以生物单位（IU/Unit）表示时，用Units/ml表示浓度。
λ=指凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度，或指浊度法或显色法使用的标准回归曲线上最低点（IU/ml）的对应值。
凝胶法（方法A和B）
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量内毒素的方法。
在标准条件下，可引起鲎试液凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。
为确保试验结果精确、有效，应根据预备试验中的说明开展试验，复核鲎试剂的标示灵敏度和试验的干扰因素。
（1）预备试验
（i）鲎试剂的标示灵敏度复核试验
灵敏度用IU/ml表示。
应在鲎试剂用于检查内毒素之前对灵敏度进行复核；
复核试验需要制备标示灵敏度λ的4支平行管。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
用BET检查用水稀释内毒素储备标准溶液，制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四种浓度的标准溶液。
在每支试管中，分别混合等体积（通常为0.1mL）的鲎试液（lysatesolution）和标准溶液。
如使用的是装有鲎试剂冻干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。
按照鲎试剂生产商的建议，将反应混合物孵育一段时间（通常在37±
1℃下保温60±
2分钟），在此过程中，不能振动试管。
凝胶的完整性测试：
如使用试管作为容器，先将试管从保温箱中取出，再缓缓将试管倒转1800。
如果形成了坚实的凝胶，倒转后凝胶不移位，此时将该项检查的结果记录为阳性。
如未能形成坚实且不变形的凝胶，该项检查的结果即为阴性。
仅在最低浓度的标准溶液的所有平行管的检查结果均为阴性的情况下，试验方为有效。
反应终点浓度指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
将终点浓度取对数，计算它们的平均值，再将平均值的结果取反对数，最后的表达式如下：
终点浓度的几何平均值＝lg-1（Σe/f）
Σe＝所用系列溶液的终点浓度的对数值的和
f＝平行管的数量
反应终点的浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测量值（IU/ml）。
当终点浓度的几何平均值在0.5λ至2.0λ之间时，可判定受试鲎试剂的标示灵敏度为λ，可用于内毒素的检查。
（ii）干扰因素试验
按表2.6.14.-1制备溶液A、B、C、D。
供试品的稀释度不得超过MVD，且供试品溶液不能检查出内毒素，具体操作见
（1）预备试验，（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。
表2.6.14-1
溶液
内毒素浓度/配制内毒素的溶液
稀释剂
稀释倍数
稀释后内毒素的浓度
平行管数
A
无/供试品溶液
－
4
B
2λ/供试品溶液
供试品溶液
1
2
8
2λ
1λ
0.5λ
0.25λ
C
2λ/BET检查用水
BET检查用水
D
0/BET检查用水
A=经检查无内毒素的溶液
B=干扰实验用
C=鲎试剂标示灵敏度的对照品
D=阴性对照品（BET检查用水）
根据
（1）预备试验下的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项中列出的公式，计算B和C溶液的终点浓度的几何平均值。
如试验条件发生了任何可能影响到试验结果的变化，须重新进行干扰因素试验。
只有当溶液A和D的所有平行管中无反应、且溶液C的结果在复核的鲎试剂灵敏度范围内时，试验方有效。
经测定，如果溶液B的灵敏度在[0.5λ，2.0λ]间，可判定供试品溶液在该实验条件下，对实验无干扰；
反之则判定供试品溶液对试验能形成干扰。
若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
使用灵敏度更高的鲎试剂进行内毒素的检查时，因为灵敏度更高的鲎试剂能排除实验的干扰因素，供试品的稀释倍数也可适当放宽。
可通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰实验。
（2）限度试验（方法A）
（i）方法
按表2.6.14-2制备溶液A、B、C、D。
实验方法见
（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。
表2.6.14-2
0/供试品溶液
制备溶液A、B（供试品阳性对照），稀释倍数不得超过MVD。
按照
（1）预备实验，（ii）干扰因素实验项下的说明开展实验。
溶液B、C（阳性对照）所含标准内毒素的浓度为鲎试剂标示灵敏度的两倍。
溶液D（阴性对照）为BET检查用水。
（ii）结果判断
只有溶液B和C的平行管的试验结果均为阳性、溶液D的平行管的试验结果均为阴性时，试验方有效。
溶液A的平行管的试验结果均为阴性时，可判定供试品符合试验的内毒素限度要求。
如溶液的平行管的检查结果均为阳性时：
-如供试品的稀释倍数为MVD，供试品不符合规定。
-如供试品的稀释倍数小于MVD，应将供试品溶液稀释至较大但不超过MVD的倍数，再次开展实验。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
如复试中，溶液A的两个平行管均呈阴性，可将供试品判为符合内毒素限度要求。
（3）半定量试验（方法B）
通过将供试品滴定至反应终点，对供试品所含的细菌内毒素定量。
按表2.6.14-3制备溶液A、B、C、D。
具体实验操作见
（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。
表2.6.14-3
-
无/BET检查用水
溶液A=不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。
从通过干扰试验的稀释倍数开始，用BET检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，每一浓度准备两份稀释液，最后的稀释倍数不得超过MVD，并且确定稀释液通过了干扰试验。
也可以准备其它合适倍数的稀释液。
溶液B=2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）
溶液C=含有2λ、λ、0.5λ和0.25λ浓度标准内毒素的BET检查用水系列，每一浓度准备两份。
溶液D=BET检查用水（阴性对照）
（ii）计算和结果判断
符合下列三个条件时，可将试验判为有效：
（a）溶液D（阴性对照）的两组平行管均显阴性，
（b）溶液B（供试品阳性对照）的两个平行管均显阳性，
（c）溶液C的终点浓度的几何平均值在0.5λ—2λ之间。
测定溶液A的内毒素浓度，计算溶液A的系列稀释液的终点浓度时，应将内毒素浓度记为终点稀释倍数乘以λ。
供试品的内毒素浓度指这些平行管的反应终点浓度的几何平均值（见
（1）预备试验项下的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项下的公式）。
如实验使用的是供试品的稀释液，计算时，将检查结果乘以稀释倍数，即得到原始溶液的内毒素浓度。
如在有效的实验中，供试品的检查结果均显阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如实验使用的是供试品的稀释液，检查结果应记为内毒素浓度小于λ乘以供试品的最小稀释倍数）。
如供试品的所有结果均为阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ（如，在表2.6.14-3中，初始稀释倍数×
8×
λ）。
如内毒素的浓度小于其专论中的规定浓度，可判定供试品符合检查要求。
光度测定法（方法C、D、E和F）
（1）浊度法（方法C和F）
本法是利用光学试验来测定浊度增加的方法。
根据检测原理，这种方法又可分为终点浊度法和动态浊度法。
终点浊度法（方法F）系依据反应混合物在孵育终止时，反应混合物的浊度（吸光度或透光率）与内毒素浓度之间的量化关系来测定内毒素含量的方法。
动态浊度法（方法C）是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的浊度到达某一预先设定的吸光度需要的反应时间（起效时间，onsettime），或是检测浊度变化率。
根据鲎试剂生产商的建议，光度测定试验应在孵育温度下进行（通常为37±
1℃）。
（2）显色法（方法D和E）
该法系利用检测鲎试剂与内毒素反应使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素的含量的方法。
根据检测原理，这种方法又可分为终点显色法和动态显色法。
终点显色法（方法E）是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。
动态显色法（方法D）是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间（起效时间，onsettime），或检测色度增长速度的方法。
（3）预备试验
为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。
当实验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需要验证试验方法。
（i）标准曲线的可靠性试验
用内毒素标准溶液制成至少三个浓度的稀释液，以获取标准曲线。
按照鲎试剂生产商的建议（体积比、孵育时间、温度、pH等），每一内毒素标准浓度的溶液至少做三支平行管。
使用动态法检测时，如预期范围超过2log，为使标准曲线反映出每个对数增长（logincrease），应相应增加标准品溶液。
在鲎试剂生产商规定的内毒素浓度范围内，相关系数的绝对值︱r︱必须大于等于0.980。
选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。
按表2.6.14-4制备溶液A、B、C、D。
在鲎试剂生产商的建议测试条件（供试品和鲎试液体积、供试品于鲎试液的体积比、孵育时间等）下，对这些溶液开展试验，每种溶液至少做两组平行。
表2.6.14-4
内毒素浓度
配制内毒素的溶液
平行管或微孔数
无
不少于2个
标准曲线的中点
至少3个浓度（最低浓度规定为λ）
每一浓度不少于2个
溶液A=稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。
溶液B=加入了标准曲线终点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的、且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。
溶液C=如“3.预备实验（i）标准曲线的可靠性试验”项下描述的、用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
用含标准内毒素的供试品溶液的平均内毒素含量减去供试品溶液的平均内毒素含量，计算内毒素的平均回收率。
当内毒素的回收率在50％－200％之间时，可认为在此试验条件下供试品溶液中不存在干扰因素。
在溶液中不添加任何内毒素的条件下，计算任何所测内毒素的减少。
当内毒素的回收率不在指定范围内，应根据凝胶法章节的“1.预备实验（ii）干扰因素实验”项下的说明排除干扰因素。
重复干扰因素实验以验证处理的有效性。
（4）检查法
按“（3）预备试验下的（ii）干扰因素试验”项下操作步骤。
（ii）计算
用系列溶液C生成的标准曲线计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方有效。
a.溶液D（阴性对照）的试验结果不得大于所用鲎试剂的说明书中规定的空白值的限度。
b.阳性对照系列溶液C的检查结果要符合“3.预备实验（i）标准曲线的可靠性试验”中的要求。
c.用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的回收率在50％－200％的范围内。
（iii）结果判断
若校正了稀释倍数和浓度后，由溶液A的内毒素浓度计算得到的供试品内毒素平均浓度小于供试品的内毒素限度，可判断供试品符合细菌内毒素检查的要求。
（5）试剂
（i）鲎试液
根据鲎试剂生产商的建议，用BET检查用水或缓冲液溶解鲎试剂，轻轻搅拌。
根据鲎试剂生产商的建议，在冷冻或冰冻条件下贮存鲎试液。
（ii）鲎试剂
鲎试剂系从鲎（Limuluspolyhemus或Tachypleustridentatus）的变形细胞溶解物制备而来。
该试剂仅指在符合有关权威法规的生产条件下生产的鲎试剂产品。
鲎试剂除了能与内毒素发生反应外，也能与某些β-葡聚糖反应。
制备不与β-葡聚糖反应的鲎试剂时，需用鲎变形细胞溶解物中除去可与β-葡聚糖反应的G因子，或抑制G因子反应系统，这样制备得到的鲎试剂可在葡聚糖存在的情况下检测内毒素。
（iii）BET检查用水（细菌内毒素检查用水）
BET检查用水指注射用水R或由其他方法制取的内毒素含量低于所用鲎试剂的检测限的水。
下面的章节提供了相关信息。
细菌内毒素检查法：
指导原则
1.简介
革兰氏阴性菌产生的内毒素是受热原污染的药品引发毒性反应的最常见原因，它产生的热原的活性比其他来源的热原的活性要高出许多，这些内毒素属于脂多糖类。
虽然也有少数的热原属于其他物质，在排除非内毒素的热原物质的前提下，调查结果通常显示：
不含细菌内毒素的产品中也不存在热原。
干扰因素会影响内毒素与鲎试剂之间的反应，所以它们的存在可能会掩盖产品中存在热原的事实。
因此，希望用细菌内毒素检查代替药典要求的家兔热原检查法的分析人员必须证明细菌内毒素检查法对供试品有效，而这种做法成功的必要条件之一是除去干扰因素。
根据细菌内毒素检查法的要求，在该检查法的使用能被视为有效之前，必须给出下面2个方面的资料。
1.1试验用到的材料符合该检查法的要求。
必须保证BET检查用水和其他试剂不含内毒素，鲎试剂的灵敏度的检查结果必须与其生产商声明的灵敏度一致。
1.2考虑到待检产品可能会对试验造成的干扰，必须在存在和不存在待检产品的情况下分别开展试验，测量两组实验中鲎试剂的灵敏度；
测定的2个灵敏度的值不得有明显差异。
细菌内毒素检查法（2.6.14）中阐述了排除干扰因素的方法。
在存在干扰因素的情况下，在证明是否已经中和或除去了该方法的干扰因素之后，必须再开展一次试验。
附录列举了细菌内毒素检查法的各项要求的原因，以及结果的解释。
如果以鲎试剂检查法作为分析的供选方法，取代药典专论中的家兔热原检查法，需要验证此种想法的可行性。
11章给出了如何进行验证的一些指导原则。
细菌内毒素的参考方法见产品专论。
在专论没有特别说明的情况下，以方法A为参考。
如意图使用参考方法以外的其它方法，分析人员必须证明这种方法对该待检产品的适用性，并表明这种方法与参考方法在检查结果上的一致性（见13章）。
2.方法
向鲎试剂中加入内毒素会引起浊度的变化、沉淀的生成或引发凝集反应；
药典之所以选择凝胶法作为细菌内毒素的第一类检查的评估标准，是因为该法在判断供试品是否合格上存在简明性的优势：
用肉眼即可观察到是否有凝胶生成。
方法C、D、E、F均为稍后研发出的定量方法：
这些方法有较多的仪器要求，但如果是同种产品的大量样品的常规自动化检查，使用它们就较为简便。
某些塑料或玻璃制成的试管或吸量管的表面可能会吸附内毒素，而塑料释放的物质又可能会引发干扰因素的出现。
所以，应检查所用的材料。
考虑到之后批次的试管或吸量管可能会与之前的批次在组分上有轻微的差异，因此，建议检验员在使用新的批次的试管或吸量管进行试验之前，先要重复材料的检查试验。
首先，应将细菌内毒素检查法用作限度试验，测出待检产品的内毒素浓度的限值；
接下来的检查目标是判断待检产品的内毒素浓度是否在限值的范围内。
定量方法C、D、E、F用于确定供试品中内毒素的含量；
不管是药典还是常规质量控制，它们的最终疑问都是内毒素的含量是否超过了指定限度。
设定待检产品的内毒素的浓度限值时，应将供试品的剂量纳入考虑范围；
限值的设定值应能确保：
只要产品的内毒素浓度小于限值，即使在指定的给药途径以每小时最大的给药剂量服药，也不会引起毒性反应。
产品的内毒素含量近似等于限值时，如果内毒素的浓度较高，会出现凝胶，产品的检查结果会不合格，这是由该检查法的性质决定的：
要么出现反应，要么完全没有反应。
因此，该检查法不能区分接近限值（小于限值）和稍高于限制的内毒素浓度。
但只要没有凝胶出现，检验员即可判定供试品的内毒素浓度低于限值。
就固体产品而言，每质量单位或每国际单位产品中内毒素的浓度限值应换算成每毫升供试品溶液的内毒素浓度表示方式。
因为该方法只能在液体状态下使用。
液体供试品（如输液制剂）的相关讨论如下。
内毒素限值依产品专论中的给药途径和剂量而定。
K的值见表2.6.14-15。
表2.6.14-5
给药途径
K（内毒素IU/公斤体重/小时）
静脉注射
5.0
放射性药物的静脉注射
2.5
鞘内注射
0.2
如产品的稀释液在试验中得到了阴性结果，是否意味着获得了最大程度的保证？
阴性结果是否代表供试品的内毒素浓度低于内毒素限度，而阳性结果又是否表示鲎试剂检测到的内毒素浓度近似等于或高于内毒素限度？
这一点由鲎试剂的灵敏度和内毒素限度决定：
最大稀释度（MVD）和它的计算式如下：
供试品溶液的浓度：
-当内毒素限度以生物活性（IU/Unit）表示时，用Units/ml表示浓度。
-当内毒素限度以体积（IU/ml）表示时，用ml/ml表示浓度。
如最大有效稀释倍数不为整数，为了日常使用的便利，可取稍小于MVD的整数值（如此一来，制备的供试品溶液的稀释倍数会小于MVD）。
此时，检查的阴性结果表示内毒素的浓度低于限值。
不过，如果供试品的内毒素浓度低于内毒素限度，但足以与鲎试剂引发凝胶反应，在该试验条件下，检查结果呈阳性。
在这种情况下，以“便利”的稀释倍数稀释的供试品的检查结果为阳性时，应将供试品以MVD稀释，重复试验。
只要检查结果存在争议，就必须采用MVD进行稀释。
这也突出了鲎试剂灵敏度复核试验的重要性。
例
待检品为50mg/ml的苯妥因钠溶液（静脉注射用）。
计算MVD。
变量数据如下：
M=最大人用剂量=15mg每千克体重每小时，
C=50mg/ml,
K=5IU内毒素每千克体重每小时，
λ=0.4IU内毒素每毫升
在该产品的日常检验中，将1ml供试品溶液稀释至20ml是方便的做法（MVD/2后，得到的值取最接近的较小的整数）。
但是，如果以该稀释倍数稀释供试品，得到的检查结果呈阳性且可疑的话，检验员有必要将1ml稀释至41.67ml。
3.参照标准品
内毒素标准BRP说明了参照标准品的制备方法。
它已用内毒素WHO国际标准品测定了含量，它的效价单位以内毒素国际单位/安瓿表示。
内毒素国际单位定义为一定量的国际标准品的活性。
就日常使用而言，也可使用另一种内毒素制剂，只要选用的内毒素制剂已用内毒素国际标准品或BRP标准品测定了含量，且它的效价单位以内毒素国际单位表示。
1国际单位（IU）等于1内毒素单位（E.U.）。
4.BET用水
基于实践和理论原因，用家兔热原检查法衍生的方法来检查试剂中内毒素的含量是不可取的，因为：
4.1用于对产品开展测试的BET检查用水的内毒素含量限值相当低，家兔检查法的灵敏度不足以检测BET检查用水的内毒素。
4.2家兔体温的升高的精确度相对较低，因此需要在多只家兔身上开展平行试验。
4.3“热原”和“内毒素”所指物质的涵盖范围并不完全重合。
根据细菌内毒素检查法的具体内容，可以看出BET检查用水的制备方法并不是三次蒸馏。
在这里，使用反渗透技术的优势很明显，也有些检验员认为蒸馏次数大于三次是较好的方法。
不论使用哪种方法，得到的产物不能检测出内毒素。
5.混合物的pH值
检查细菌内毒素时，pH值在6.0-8.0之间时，获得的凝胶最为理想。
不过，要注意的是，供试品中
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