食管癌相关纤维细胞对食管癌放疗敏感性的影响及其作用机制研究.docx

食管癌相关纤维细胞对食管癌放疗敏感性的影响及其作用机制研究.docx

《食管癌相关纤维细胞对食管癌放疗敏感性的影响及其作用机制研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食管癌相关纤维细胞对食管癌放疗敏感性的影响及其作用机制研究.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

食管癌相关纤维细胞对食管癌放疗敏感性的影响及其作用机制研究

报告正文

1.申请人简历

姓名：

研究工作经历

2.立项依据与研究内容

（1）项目的立项依据。

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，每年新诊断25万新发病例，占全世界1/2，死亡率17.38/10万，占全部恶性肿瘤死亡的16.05％，居第四位。

食管癌临床确诊时约70%-80%的患者已丧失手术机会，放疗成为局部晚期食管癌的主要治疗手段。

单一放疗的疗效有限，2年存活率仅10%左右。

目前标准的同步放化疗的5年生存率也仅在20%左右，而50%以上的病例治疗后出现局部复发[1,2]。

如何提高食管癌治疗效果是临床需要解决的棘手问题。

研究发现食管癌治疗过程中表现出的获得性放疗抵抗性是阻碍食管癌放疗效果进一步提高的重要因素。

因此，深入研究食管癌获得性放疗抵抗性的形成机制，寻找临床可干预的新靶点，设计相应的治疗策略加以逆转，是能否进一步提高食管癌放疗效果的关键。

一、食管癌放疗抵抗分子机制研究现状

课题组前期通过梯度剂量照射法及单克隆筛选法成功建立了人食管鳞癌放疗抵抗细胞株KYSE-150R，其D0、Dq与其母株KYSE-150相比有显著提高，提示KYSE-150R细胞株获得了明显的放疗抵抗性。

我们进一步的研究发现采用EGFR特异性抗体西妥昔单抗可以在一定程度上逆转KYSE-150R细胞株的放疗抵抗性[3-4]。

此外，其他研究人员发现下调Bmi-1表达同样可以缓解KYSE-150R细胞株的放疗抵抗性[5]。

上述这些及近年来报道的针对食管癌放疗抵抗性的分子机制研究都是着眼于食管癌细胞本身，而未关注肿瘤微环境对食管癌放疗敏感性的影响[6-9]。

近年来，越来越多的研究证实，肿瘤微环境对于肿瘤的治疗敏感性亦起着至关重要的作用，有效的联合治疗策略总是同时针对肿瘤和其宿主微环境两个重要因素[10-11]。

肿瘤微环境主要由纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、基质膜等构成，是肿瘤细胞的保护伞，可通过调节肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用或肿瘤细胞之间的相互作用来介导肿瘤细胞的治疗抵抗、转移侵袭等恶性增殖能力[12-13]。

二、肿瘤相关纤维细胞对肿瘤放疗敏感性的重要影响

肿瘤相关纤维细胞（cancerassociatedfibroblasts,CAFs）作为肿瘤微环境发挥其对癌细胞影响作用的主要执行者，可通过激活自分泌或旁分泌信号通路调控肿瘤细胞的DNA损伤修复响应、促结缔组织增生反应等，从而诱导肿瘤组织产生放疗抵抗性[14]。

如肿瘤相关纤维细胞在放射线的刺激下可分泌转化生长因子beta（TGF-beta）。

而TGF-beta可与其癌细胞表面的受体结合启动下游的信号通路，导致细胞内识别DNA损伤的ATM激酶活性上调，从而启动细胞内DNA损伤修复响应，增加肿瘤细胞的抗凋亡能力[15]。

研究证实采用TGF-beta受体的抑制剂LY364947阻断TGF-beta介导的细胞内抗凋亡信号通路可使胶质瘤细胞株的放疗敏感性增加25%。

体内实验亦表明采用TGF-beta的特异性抗体可使放疗后的肿瘤生长延迟时间显著延长[16]。

此外，有研究表明肿瘤相关纤维细胞亦介导了前列腺癌、乳腺癌的放疗抵抗性。

如前列腺癌相关纤维细胞在放射性或药物的刺激下可分泌WNT16B，而WNT16B可与其癌细胞表明的受体结合并启动癌细胞内的Wnt/β-catenin抗凋亡信号通路，从而介导了前列腺癌获得性放疗抵抗性的形成[17]。

而肿瘤相关纤维细胞在乳腺癌的放疗反应中亦发挥了重要作用。

研究发现低剂量的放射线可导致乳腺癌相关纤维细胞发生早衰，而早衰的乳腺癌相关纤维细胞可导致乳腺癌细胞增殖加快，放疗敏感性下降[18]。

肿瘤相关纤维细胞除了能分泌多种细胞因子来激活肿瘤细胞内的抗凋亡信号通路导致肿瘤放化疗抵抗性的产生，它还能为肿瘤细胞的生长提供生物力学上的支持。

例如鳞状细胞癌（SCC）为保持其侵袭力，需要其宿主微环境里的纤维细胞不断加入补充。

3D共培养试验研究发现，CAFs总是作为开路先锋，与SCC细胞一起侵犯胶原蛋白层，促进SCC细胞的转移侵袭[19]。

有研究发现肿瘤复发灶、转移灶与其原发灶相比，放疗敏感性显著下降。

因此，我们推测CAFs除了可通过分泌多种细胞因子激活肿瘤细胞内的抗凋亡信号通路还可通过促进肿瘤细胞的转移侵袭能力来介导肿瘤放疗抵抗性的产生。

因此，CAFs作为肿瘤放疗抵抗性的直接介导者，应对其进行深入的研究，开发其肿瘤干预能力，提高肿瘤治疗的敏感性及特异性，使现阶段肿瘤治疗的诸多瓶颈问题能有所突破。

近年来，CAFs在肿瘤进展中发挥的巨大作用已日渐清晰，抑制CAFs的活性将成为未来肿瘤靶向治疗的一个新前景。

三、食管癌相关纤维细胞的研究进展及本课题组的研究发现

研究显示食管癌相关纤维细胞与正常食管纤维细胞相比，可分泌多种与细胞增殖、血管发生、细胞粘附性、运动性、转移侵袭能力相关的因子，如FGF18、IL8、MMP10、CLDN1及LEF1等[20]。

若将食管癌细胞培养在食管癌相关纤维细胞的培养基中，可观察到食管癌细胞增殖加快、运动性及侵袭能力增加，提示食管癌相关纤维细胞对于食管癌的发生发展起着至关重要的作用，值得进行进一步的深入研究。

基于肿瘤相关纤维细胞可直接介导肿瘤放疗抵抗性的产生，靶向肿瘤相关纤维细胞对于肿瘤的根治性治疗具有重要的意义，因此亟待阐明肿瘤相关纤维细胞对于食管癌放疗敏感性的影响及其具体的作用机制。

然而，迄今为止，尚未有相关的研究报道。

我们前期的研究中通过采用原代培养的方法成功地从食管鳞癌患者的手术标本中分离了食管癌相关纤维细胞。

我们将食管癌细胞KYSE-150分别培养于普通培养基（Gibco1640培养基，10%BSA，1%双抗）中、食管癌相关纤维细胞的培养基（将食管癌相关纤维细胞培养于添加有20%BSA及1%双抗的Gibco1640培养基，待细胞覆盖率约80%时，收集培养基，1000rpm离心30分钟，取上清）中。

结果显示培养于食管癌相关纤维细胞培养基中的KYSE-150细胞放疗后的细胞存活率显著高于培养于普通培养基中的存活率。

而且，我们进一步的研究证实培养于食管癌相关纤维细胞培养基中的KYSE-150细胞放疗后的DNA损伤分子标记物γ-H2AX的表达量及细胞凋亡率显著低于培养于普通培养基中的γ-H2AX的表达量及细胞凋亡率。

上述结果提示食管癌相关纤维细胞可直接介导食管癌细胞KYSE-150放疗抵抗性的形成。

此外，我们研究发现将KYSE-150细胞培养于食管癌相关纤维细胞的培养基中两天后，可观察到KYSE-150的细胞形态发生明显的改变，由原来的不规则形变为狭长的纺锤状，该表型的变化类似于上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）。

已知肿瘤发生EMT转变常伴随着放疗抵抗性的增强[21-23]。

因此我们推测食管癌相关纤维细胞介导的食管癌放疗抵抗性可能与诱导食管癌发生EMT转变有关。

基于上述重要发现，本研究中我们拟通过采用多个食管癌细胞株进一步验证食管癌相关纤维细胞可介导食管癌放疗抵抗性的形成，同时通过采用芯片检测技术（humancDNAmicroarray）、细胞转染技术及其他多项分子实验技术深入地研究食管癌相关纤维细胞介导食管癌放疗抵抗性形成的分子机制，筛选出能够逆转食管癌放疗抵抗性的分子靶点。

该研究工作将弥补肿瘤微环境在食管癌放疗抵抗性研究领域中的空白，并为临床研究如何提高食管癌患者的放疗效果提供参考依据和理论指导。

参考文献

1.CooperJS,GuoMD,HerskovicA,MacdonaldJS,MartensonJAJr,Al-SarrafM,ByhardtR,RussellAH,BeitlerJJ,SpencerS,AsbellSO,GrahamMV,LeichmanLL.Chemoradiotherapyoflocallyadvancedesophagealcancer:

long-termfollow-upofaprospectiverandomizedtrial（RTOG85-01）.JAMA.1999;281（17）:

1623-1627.

2.张萍,谢聪颖,吴式琇.紫杉醇联合铂类与放疗同步治疗局部晚期食管癌的临床研究.中华肿瘤杂志.2007;29（10）:

773-777.

3.张力,李海英,吴式琇.X线反复照射人食管鳞癌细胞系KYSE-150的生物效应研究.中华放射肿瘤学杂志.2010;19

（1）:

60-63.

4.JingZ,GongL,XieCY,ZhangL,SuHF,DengX,WuSX.ReverseresistancetoradiationinKYSE-150Resophagealcarcinomacellafterepidermalgrowthfactorreceptorsignalpathwayinhibitionbycetuximab.RadiotherOncol.2009;93（3）:

468-473.

5.WangG,LiuL,SharmaS,LiuH,YangW,SunX,DongQ.Bmi-1confersadaptiveradioresistanceto KYSE-150R esophagealcarcinomacells.BiochemBiophysResCommun.2012;425

（2）:

309-14

6.SakakuraC, MiyagawaK, FukudaKI, NakashimaS, YoshikawaT, KinS, NakaseY, IdaH, YazumiS, YamagishiH, OkanoueT, ChibaT, ItoK, HagiwaraA, ItoY.Frequent silencing of RUNX3 in esophageal squamous cell carcinomas is associated with radioresistance andpoor prognosis.Oncogene. 2007;26（40）:

5927-38.

7.CheSM, ZhangXZ, HouL, SongTB.Cyclooxygenase-2 inhibitor NS398 enhances radiosensitivity of radioresistant esophageal cancer cells byinhibiting AKT activation and inducing apoptosis.Cancer Invest. 2010;28（7）:

679-88.

8.AkamatsuM, MatsumotoT, OkaK, YamasakiS, SonoueH, KajiyamaY, TsurumaruM, SasaiK.c-erbB-2 oncoprotein expression related to chemoradioresistance in esophageal squamous cell carcinoma.IntJRadiatOncolBiolPhys. 2003;57（5）:

1323-7.

9.MatsuyamaA, InoueH, ShibutaK, TanakaY, BarnardGF, SugimachiK, MoriM.Hepatoma-derived growth factor is associated with reduced sensitivity to irradiation in esophageal cancer.Cancer Res. 2001;61（15）:

5714-7.

10.KararJ,MaityA.Modulating the tumormicroenvironment to increase radiation responsiveness.CancerBiolTher.2009;8（21）:

1994-2001.

11.Barcellos-HoffMH,ParkC,WrightEG.Radiationandthemicroenvironment-tumorigenesisandtherapy.NatRevCancer.2005;5（11）:

867-75.

12.SungSY, HsiehCL, WuD, ChungLW, JohnstonePA.Tumormicroenvironment promotes cancer progression, metastasis,and therapeutic resistance.CurrProbl Cancer. 2007;31

（2）:

36-100.

13.DenysH,BraemsG,LambeinK,PauwelsP,HendrixA,DeBoeckA,MathieuV,BrackeM,DeWeverO.Theextracellularmatrixregulatescancerprogressionandtherapyresponse:

implicationsforprognosisandtreatment.CurrPharmDes.2009;15（12）:

1373-84.

14.ChargariC,ClemensonC,MartinsI,PerfettiniJL,DeutschE.Understandingthefunctionsoftumorstromainresistancetoionizingradiation:

emergingtargetsforpharmacologicalmodulation.DrugResistUpdat.2013;16（1-2）:

10-21.

15.KirshnerJ,JoblingMF,PajaresMJ,RavaniSA,GlickAB,LavinMJ,KoslovS,ShilohY,Barcellos-HoffMH.Inhibitionoftransforminggrowthfactor-beta1signalingattenuatesataxiatelangiectasiamutatedactivityinresponsetogenotoxicstress.CancerRes.2006;66（22）:

10861-9.

16.HardeeME,MarciscanoAE,Medina-RamirezCM,ZagzagD,NarayanaA,LonningSM,Barcellos-HoffMH.Resistanceofglioblastoma-initiatingcellstoradiationmediatedbythetumormicroenvironmentcanbeabolishedbyinhibitingtransforminggrowthfactor-β.CancerRes.2012;72（16）:

4119-29.

17.SunY,CampisiJ,HiganoC,BeerTM,PorterP,ColemanI,TrueL,NelsonPS.Treatment-induceddamagetothetumormicroenvironmentpromotesprostatecancertherapyresistancethroughWNT16B.NatMed.2012;18（9）:

1359-68.

18.TsaiKK,StuartJ,ChuangYY,LittleJB,YuanZM.Low-doseradiation-inducedsenescentstromalfibroblastsrendernearbybreastcancercellsradioresistant.RadiatRes.2009;172（3）:

306-13.

19.GaggioliC,HooperS,Hidalgo-CarcedoC,GrosseR,MarshallJF,HarringtonK,SahaiE.Fibroblast-ledcollectiveinvasionofcarcinomacellswithdifferingrolesforRhoGTPasesinleadingandfollowingcells.NatCellBiol.2007;9（12）:

1392-400.

20.ZhangC, FuL, FuJ, HuL, YangH, RongTH, LiY, LiuH, FuSB, ZengYX, GuanXY.Fibroblast growth factor receptor2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumordevelopment and progression in eso-phageal carcinoma.ClinCancerRes. 2009;15（12）:

4017-27.

21.TheysJ, JuttenB, HabetsR, PaesmansK, GrootAJ, LambinP, WoutersBG, LammeringG, VooijsM.E-Cadherin loss associated with EMT promotes radioresistance in human tumor cells.RadiotherOncol. 2011;99（3）:

392-7.

22.ChibaN, ComaillsV, ShiotaniB, TakahashiF, ShimadaT, TajimaK, WinokurD, HayashidaT, WillersH, BrachtelE, VivancoMD, HaberDA, ZouL,MaheswaranS.Homeobox B9 induces epithelial-to-mesenchymal transition-associated radioresistance by accelerating DNAdamage responses.ProcNatlAcadSciUSA. 2012;109（8）:

2760-5.

23.TiwariN, GheldofA, TatariM, ChristoforiG.EMT asthe ultimate survival mechanism of cancer cells.Semin Cancer Biol. 2012;22（3）:

194-207.

（2）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。

研究内容：

1.采用多个食管癌细胞如KYSE-30、KYSE-450及KYSE-510在细胞及分子水平上验证食管癌相关纤维细胞对于食管癌细胞放疗敏感性的影响。

如分析比较培养于普通培养基（Gibco1640培养基，添加有10%牛血清白蛋白及1%双抗）中及培养于食管癌相关纤维细胞的培养基（将培养食管癌相关纤维细胞的培养基离心，取上清）中的食管癌细胞放疗后的细胞生长、细胞凋亡、细胞存活、细胞克隆形成能力等情况，以及检测上述不同培养条件下食管癌细胞放疗后的DNA损伤程度、PARP及caspase-3,7,9的表达及活性等。

2.筛选食管癌相关纤维细胞介导食管癌放疗抵抗性的分子靶点。

1）采用芯片检测技术检测食管癌相关纤维细胞放疗前与放疗后的基因表达谱的差异，将上调倍数及下调倍数前十位的基因（上调倍数或下调倍数均至少两倍以上）通过数据库查阅其功能，筛选可能的介导食管癌放疗抵抗性的靶基因。

2）将上述筛选出的潜在靶基因进行功能的验证，如将表达上调的基因通过转染该基因的siRNA干扰载体下调其表达，然后比较该基因表达量下调前后食管癌细胞放疗敏感性的变化。

同时对表达下调的基因通过转染过表达载体上调其表达，并比较该基因表达量的变化能否逆转食管癌相关纤维细胞介导的放疗抵抗作用。

通过上述实验找到食管癌相关纤维细胞介导食管癌放疗抵抗性的分子靶点。

3.研究靶基因如何介导了食管癌相关纤维细胞和食管癌细胞的相互作用并导致食管癌放疗敏感性下降的分子机制。

1）研究该靶基因对食管癌细胞DNA损伤修复响应、细胞周期调控激酶、细胞存活/凋亡信号通路等的影响。

2）我们前期的研究发现食管癌细胞培养于食管癌相关纤维细胞的培养基中后，形态上发生了类似于上皮间质转化（EMT）的改变。

已知EMT的出现常伴随着肿瘤放疗抵抗性的增强。

因此，我们拟检测上述靶基因对食管癌细胞EMT分子标志物表达的影响。

研究目标：

本课题拟在前期研究工作的基础上进一步证实食管癌相关纤维细胞介导了食管癌放疗抵抗性的形成，并且阐明食管癌相关纤维细胞介导食管癌放疗抵抗作用的具体分子机制，找出相应的分子靶点来提高食管癌细胞的放疗敏感性。

拟解决的关键问题：

1.通过采用多个细胞株从细胞及分子水平上验证食管癌相关纤维细胞介导了食管癌细胞放疗抵抗性的形成。

2.通过采用芯片检测技术及细胞转染等技术筛选出食管癌相关纤维细胞介导食管癌放疗抵抗性的分子靶点。

3.阐明食管癌相关纤维细胞介导食管癌放疗抵抗性的分子机制。

（3）拟采取的研究方案及可行性分析。

研究方案：

1.研究不同培养条件下食管癌细胞放疗敏感性的变化

1）采用原代培养的方法从食管鳞癌患者的手术标本中分离、培养食管癌相关纤维细胞：

将经病理诊断证实为食管鳞癌的病人手术后所取得的癌组织在切除后1小时内送到实验室,立即开始组织的清洗和进一步操作。

组织样品经过PBS清洗2-3遍,将组织剪切成尽量小的组织块,去除坏死的区域、脂肪组织、血管及连接组织，收集剩余的癌组织并用胶原酶37°C培养箱中孵育消化l-2小时。

消化组织块后,1000rpm离心5分钟,收集细胞将其接种于细胞培养皿中,加入添加有20%BSA，1%双抗的Gibco1640培养基于37°C培养箱中培养。

因纤维细胞与癌细胞的贴壁时间有显著的差异，前者约为20-30分钟，而后者通常1小时以上。

因此培养半小时后，将已贴壁的纤维细胞与未贴壁的癌细胞分离培养，并且根据二者贴壁时间的不同，将分离的纤维细胞进行多次的纯化并通过免疫组化实验进行纤维细胞标志物的染色鉴定，最终选取培养十代以内的呈明显梭型生长的原代纤维细胞进行后续的实验。

2）收集食管癌相关纤维细胞的培养基：

将食管癌相关纤维细胞培养于75cm2培养瓶中，培养两天后，待细胞覆盖率约80%时，收集培养基，1000rpm离心30分钟，取上清，即为后续实验所提到的食管癌相关纤维细胞的培养基

3）将食管癌细胞KYSE-30、KYSE-450及KYSE-510分别培养于普通培养基中、食管癌相关纤维细胞的培养基中培养两天后，给以放