泛素Word格式文档下载.docx
《泛素Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《泛素Word格式文档下载.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
在不同生物体间组成泛素的氨基酸序列差别很小,如酵母和人的泛素仅有3个氨基酸序列的差别。
泛素能以自由的形式存在,也能和其他蛋白形成复合物。
泛素是通过一系列泛素启动酶的作用而与靶蛋白连接的。
泛素启动酶包括E1泛素激活酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶。
首先,在ATP参与下,游离的泛素被E1激活,即E1的半胱氨酸残基与泛素的C末端甘氨酸残基形成高能硫酯键。
然后,活化的泛素被转移到E2的活性半胱氨酸残基上,形成高能硫酯键。
接着,E2再将泛素传递给相应的E3。
E3可直接或间接地促进泛素转移到靶蛋白上,使泛素的C末端羧酸酯与靶蛋白赖氨酸氨基形成异肽键,或转移到已与靶蛋白相连的泛素上形成多聚泛素链。
以上即泛素化过程。
在该途径中,E3是通过识别和结合特异的靶蛋白序列或降解决定子（degron:
决定某一蛋白发生降解或部分降解的序列）来特异性地调节靶蛋白的降解代谢。
根据识别靶蛋白序列中结构域不同,E3又分为两类:
（1）HECT型E3连接酶,HECT结构域包含保守的350个氨基酸。
该结构域上的半胱氨酸残基与泛素的硫酯键连接形成复合物Ub-E3作为过渡,再将泛素转移到靶蛋白上。
（2）RING-fingerE3连接酶,包括c-Cb1,APC和SCF,在泛素转运过程中都不直接与Ub形成过渡的蛋白复合物,而且都包含一个RING-finger结构域或一个结构相关的结构域,例如U-box结构域。
RING结构域可以与Ub-E2形成复合体,随后直接将Ub转移至靶蛋白上。
二．26S蛋白酶体系统
蛋白酶体定位于胞核和胞质内。
26S蛋白酶体是由2个环状的19S亚单位和1个20S微粒体状的亚单位组成。
19S亚单位由包含6个AAA-ATP酶的碱性亚复合体和包含8个非ATP酶的亚复合体组成。
它的功能是识别泛素化的靶蛋白并在其进入20S复合体前对其进行去泛素化、打开折叠和移位。
20S催化核心有4个环叠成圆筒状结构,其中两侧外环由1~7亚单位组成,两个内环由1~7亚单位组成,4个环的中央形成一个狭窄的孔。
亚单位促使底物移位进入中央孔隙水解中心,并使20S复合体和19S调节复合体之间发生构象改变。
亚单位N末端苏氨酸残基是蛋白酶体的水解中心,但是不同的亚单位有不同的蛋白酶活性,包括胰蛋白酶样、糜蛋白酶样和半胱氨酸蛋白酶样活性,分别能裂解羧基端碱性、疏水性或芳香性和酸性氨基酸残基,从而消化底物,释放出短肽碎片。
蛋白酶体被认为是细胞内的再生与回收中心,泛素化的靶蛋白在此被分解为短肽和氨基酸,而泛素被回收再利用。
2.1.蛋白质降解的泛素化调节
研究发现,蛋白质带有某些能被泛素系统识别的信号,这些信号包括:
（1）N-degron:
早在1986年,Varshavsky等进行了一系列试验,提出了N-末端规则,即通过蛋白质N-末端的氨基酸来预测它的半衰期,如蛋白质N-末端是丝氨酸,半衰期可以长达20h;
相反,如果是天冬氨酸,半衰期只有3min。
但N-degron如何启动并标记泛素的机制还不清楚。
（2）有些氨基酸序列是降解的信号:
PEST序列是其中之一,在短短8个氨基酸的片段上,富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
如转录因子Gcn4p,有281个氨基酸,PEST序列位91~106,此蛋白正常的半衰期大约为5min,如果将PEST序列移除,半衰期增加到50min。
此外,有时信号也可能隐藏在疏水核心中或被掩盖。
当一些蛋白以天然状态存在时,信号被隐藏,蛋白不被降解。
但蛋白结构出现变化如出现部分解链区,信号就会暴露而被泛素系统发现并降解。
这就是为何部分折叠、异常和突变蛋白易被降解的原因。
目前,泛素-蛋白酶体途径对蛋白质降解信号的识别和它们被标记的具体机制仍然不清楚。
2.2.去泛素化酶系统
特异性的去泛素化酶主要有两大类:
（1）泛素羧基末端水解酶家族（ubiquitinC-terminalhydrolases,UCHs）,属于半胱氨酸蛋白酶。
UCHs通常是小分子蛋白,包括UCHL-1,-2,-3等分子。
UCHs可以通过裂解C末端76位甘氨酸将泛素分子从小的多肽底物上释放出来。
现已发现UCHs与一些疾病及肿瘤关系密切。
如UCHL-1主要分布在神经组织,与帕金森病等发病有关;
（2）泛素特异性修饰酶家族（ubiquitin-specificprocessingenzymes,UBPs）包括Ubp-M,UBP41,UBP4,HAUSP,ISOT1等,这些酶分子都含有2个短而保守的片段即Cys盒和His盒,包括了所有有催化作用的残基,UBPs能将泛素分子从大的蛋白上移除。
总之,两组酶都能催化水解泛素分子C末端的多肽链连接,起到去泛素化作用。
目前,利用泛素化或去泛素化来调控细胞内蛋白质的水平,并影响其功能已成为蛋白质研究的一个重要策略。
如已知P53的泛素化降解与许多肿瘤发生相关。
1997年发现UBP成员疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶（herpesvirus-associatedUb-specificprotease,HAUSP）与细胞核内分子结合,与前髓细胞白血病发病相关,随着研究的深入,Muyang等证实HAUSP能特异性结合P53泛素化链,使其去泛素化,P53降解减少,稳定性增强,并抑制肿瘤细胞的生长。
三．蛋白质降解的泛素化调节和去泛素化调节
研究证实,细胞内80%~90%的蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。
泛素的靶蛋白包括:
细胞周期调节因子、肿瘤抑制因子、转录激活因子和抑制因子、细胞表面受体以及突变或受损蛋白质,通过以上
靶蛋白的多聚泛素化并经蛋白酶体降解后,可以影响或调节多种细胞活动。
但随着对泛素-蛋白酶体途径的研究深入,进一步发现蛋白泛素化调节是一个可逆的过程。
细胞内同时还存在一些特异的去泛
素化蛋白酶进行负向调节
3．1．泛素化途径与细胞周期
由依赖于SCF的泛素化途径参与降解的与细胞周期有关的蛋白CyclinD是细胞周期中Gl期向S期过渡的重要的调控因子,它与CDK4、6结合,使Rb发生磷酸化而失活,释放出转录因子EZF,转录因子进入细胞核内,转录出介导Gl期向期过渡的调控因子。
如果CyclinDl过量表达,则会导致细胞加速通过Gl期和S期。
研究发现Cy-elinDl的降解是由于CDC34和SCFskpZ相互作用的结果。
在Gl期,CychnDl定位于细胞核上;
在S期,CychnDl则定位于细胞质上。
如果使定位于细胞核上的CyclinDl第268位上的氨基酸发生磷酸化,则会使在S期定位于细胞质上的CyclinDI被泛素化降解。
如果使CyelinDl第268位氨基酸发生突变,突变的CyclnDl会定位于细胞核中,并且一直表达图。
这说明CyclinDl通过泛素化途径降解可能受到细胞定位和磷酸化两个方面的调控。
但是关于CychnDl降解的生物学意义还在研究中。
cyclnE在Gl期的晚期到S期的早期与CDKZ相结合,启动了DNA的复制。
如果在细胞中CyclinE过度表达,会使细胞提早进入S期,造成细胞基因组的不稳定和肿瘤的形成。
有研究证明,无论是独立存在的CychnE,还是与CDKZ结合的CyclinE都是通过泛素化途径降解的。
Nakayajna等发现在小鼠中,如果Cullins和基因失活,会造成细胞中CychnE含量的增加,这说明与CDKZ结合的CychnE是由依赖SCF的泛素化途径降解的。
如果使与CDKZ结合的CychnE在第380位的苏氨酸上发生磷酸化,则CychnE被泛素化,进而被降解。
而独立存在的CychnE的降解不需要被磷酸化,它的降解模式与处于结合状态的Cy-elil,E是不同的。
研究发现,Fbw7/hCed4/Ago（属于F一boxproteins家族的蛋白质）的变异会阻止Cy-eli,IE被泛素化降解。
对Fbw7/hCed4/Ago变异的研究也暗示F一boxproteins变异是人类肺癌和卵巢癌的致病机理。
3．2．泛素化和磷酸化协同作用调控蛋白质降解
越来越多的研究发现，丝氨酸和苏氨酸的磷酸化可以使底物蛋白质迅速经泛素蛋白酶体途径降解，一种叫。
在细胞外信号的刺激下，可诱导的磷酸化使得泛素化机器能够识别磷酸化底物并对底物进行泛素化标记，从而启动蛋白质降解。
真核生物的细胞周期是高度有序的调控过程，参与细胞周期调控的的主要调节因子包括：
!
细胞周期蛋白，因其含量在细胞周期中呈周期性变化而被发现并得名；
细胞周期蛋白依赖性激酶的激酶活性被顺序激活，从而驱动细胞周期周而复始地转动，细胞不断增殖；
#细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，与结合并抑制其活性。
3．3．泛素化介导的非蛋白质降解功能
基因组频繁地受到外部的（如辐射）和内部的（如复制错误）各种损伤因子作用，引起损伤，因此DNA修复是保持基因组完整性所必需的．1987年发现DNA修复基因RAD6编码Ub结合酶（E2），第一次揭示了Ub在DNA修复中的作用。
自此，泛素化被看作调节各种DNA修复过程的中心机制。
DNA损伤反应（DDR）是由若干蛋白质构成的信号级联反应，这些蛋白质充当DNA损伤的传感器、DNA损伤信号转导器、协调DNA修复的效应器．显然，许多DDR途径信号转导器是酶，这些
酶催化泛素化或催化蛋白质聚集UBD。
已发现Ub在3种DDR途径中起作用：
DNA跨损伤合成、范可尼贫血症和DNA双链断裂修复．这些DNA损伤耐受机制在避免破坏DNA复制叉或在避免更具危害性的DNA双链断裂中发挥着至关重要的作用。
1细胞核增殖抗原修饰和DNA跨损伤合成修复
细胞核增殖抗原（PCNA）是三聚体复制滑动夹，该夹绕着DNA，为招募其他涉及DNA复制和修复的蛋白质提供一个平台．当DNA受到紫外线或烷化剂损伤时，RING域E3（RAD18）被RPA（一种单股结合DNA的蛋白质）招募至失速的复制叉，然后RAD18和RAD6（一种E2）使失速复制叉上的PCNA在K164处单泛素化，单泛素化PCNA招募跨损伤合成（TLS）聚合酶以置换高保真复制聚合酶．TLS聚合酶一般显示低持续合成能力和低保真度．所以TLS聚合酶可越过DNA损伤位点使复制继续．之后，TLS聚合酶被复制聚合酶置换，恢复正常的DNA复制．控制聚合酶开关的机制尚不清楚，但PCNA泛素化和去泛素化可能在这开关中起关键作用．已发现，PCNA上的Ub被Ub特异性蛋白酶1（USP1）切除[1,5,13]．研究显示，PCNA被RAD18和RAD6单泛素化后，通过Ubc13/Mms2和RAD5，使PCNA上的Ub进一步延伸至K63多聚泛素链．K63多聚泛素化激活一条称为模板开关的跨损伤途径，该途径招募DNA双链的未损伤链作为指导DNA合成的模板．研究发现，K164上的PCNA单泛素化便于易错DNA修复，而结合在同一位点的多聚泛素化介导无错DNA修复．S期内，结合PCNA的SUMO涉及正常DNA合成．因此，PCNA的同一Lys残基可经历3种不同且相互排斥的修饰．
2范可尼贫血症途径
范可尼贫血症（FA）是一种常染色体隐性遗传性疾病，可增大患癌症如白血病和鳞片状细胞癌的可能性．为应答引起链间交联的DNA损伤剂，两种FA蛋白（FANCD2和FANCl）经历单泛素化．FANCD2和FANCl形成一种复合物（ID），ID的每一亚基泛素化都需一种泛素化E3复合物，这E3复合物的催化亚基是RING域蛋白FANCL,FANCL的功能是与UBE2T（一种E2）一起催化ID单泛素化．单泛素化ID进一步将BRCA2和RAD51招募到DNA损伤位点以通过同源重组修复DNA损伤．因此FANCD2和FANCl单泛素化成为FA途径DNA修复的关键．单泛素化ID也招募TLS聚合酶以跨越DNA损伤，进行易错DNA修复．FANCD2和FANCl泛素化成为DDR中的关键事件提示，这种修饰被严密节．而ID泛素化需要一种大的多亚基E3复合物也提示，有一种精密水平调节．FA核心复合物含识别DNA结构的亚基（如含有一个解旋酶结构域的FANCM）以及与FANCD2相互作用的亚基（如FANCE）．FANCD2被ATM和ATR磷酸化．对DT40细胞的最新研究显示，FANCl在各种S/TQ基序处磷酸化是FANCD2和FANCl单泛素化所需的．如同PCNA,FANCD2泛素化可被USP1逆转．为应答DNA损伤，UPS1在转录水平和翻译水平上迅速下调，导致增加FANCD2单泛素化．
3DNA双链断裂修复
最近研究发现，K63多聚泛素化在同源重组修复DNA双链断裂（DSB）中起关键作用．如删除鸡DT40细胞中Ub结合酶13（Ubc13）或用RNAi干扰人细胞中Ubc13引发对大范围的DNA损伤剂超敏感，包括对那些诱导DSBs的DNA损伤剂超敏感．检测显示，将RPA、BRCA1和RAD51招募到DSB位点必需Ubc13．而且，在Ubc13缺失的细胞内，是破坏组蛋白突变体H2AX的泛素化而不是破坏其磷酸化．这些结果提示，K63多聚泛素化对DSB修复非常重要．最近的许多研究为K63多聚泛素化如何招募各种DNA修复蛋白质到DSB位点提供了更深刻的解．如应用MRN复合物检测DSBs，MRN复合物可在DNA损伤位点招募和激活蛋白激酶ATM，ATM磷酸化γH2AX，磷酸化的γH2AX进而招募MDC1，MDC1是一种含两个BRCT域的适应器蛋白．然后MDC1被ATM磷酸化，RNF8（一种E3）的FHA域识别磷酸化MDC1，RNF8和Ubc13一起催化包括H2AX和H2A在内的靶蛋白K63多聚泛素化．该多聚泛素链然后被RAP80UIM（Ub相互作用基序）结构域所识别，该结构域进一步招募包括Brcc36和BARD1在内的BRC1效应器复合物．因此，RNF8与Ubc13的功能是在损伤位点构建一条多聚泛素链以招募BRCA1编辑Ub的复合物．利用K63多聚泛素链招募另一个编辑Ub的复合物是细胞信号中的通常主题．如K63多聚泛素链招募A20编辑Ub的复合物以下行调节NF-κB途径，招募BRCA1复合物至DSBs是同源重组修复DNA所必需的。
3．4．组蛋白H2B泛素化修饰
近年来的研究表明,ubH2B的去泛素化对转录延伸起着重要的作用。
Ubp8是募集Ctk1、CTD区磷酸化后的RNA聚合酶和Set2到读码框5端所必需的。
在Bre1中Ctk1的定位缺陷得到了改善,表明H2B的泛素化可能对延伸过程中RNA聚合酶对Ctk1的募集起抑制作用。
Stock等研究表明,Ctk1可与组蛋白H2A、H2B相互作用,但Ctk1不能与泛素化的H2B相互作用。
Stock等认为,组蛋白H2B泛素化使RNA聚合酶在早期转录延伸中起到检验点的作用。
ubH2B的去泛素化过程是由SAGA复合物中的Ubp8催化的,该过程也需要Ctk1的募集。
Ctk1可使RNA聚合酶的CTD序列中第2位Ser发生磷酸化,RNA聚合酶S2的磷酸化为H3K36甲基转移酶Set2提供了结合位点,而Set2的结合是后续转录过程所必需的。
Ubp8与延伸中的RNA聚合酶结合,然后RNA聚合酶与SAGA的一个亚基作用,共同进入开放性读码框区域。
RNA聚合酶既可与Rad6结合,又可与Ubp8结合,说明在转录延伸过程中可能存在多次泛素化和去泛素化。
但这些因子是否同时与RNA聚合酶发生尚不十分清楚。
转录延伸过程中多次泛素化和去泛素化过程,可使RNA聚合酶的转录延伸过程间断性暂停,进而协调转录过程与mRNA的加工过程。
此外,组蛋白H2B泛素化是RNA聚合酶转录所必需的。
体外转录延伸实验表明,H2B泛素化在FACT促进RNA聚合酶在染色质上顺利延伸的过程中起辅助作用。
FACT在RNA聚合酶催化转录过程中起着分子伴侣的作用,当RNA聚合酶在染色质上滑动时,FACT可使H2A/H2B二聚体与核小体核心短暂性解离,使RNA聚合酶顺利通过核小体而在染色质上延伸。
3．5．泛素化修饰与植物免疫应答
ET参与多种生物胁迫应答,CTR1,EIN2和EIN3是ET信号途径中的关键组分。
植物对多种PAMPs的感知和病原菌感染能诱导乙烯生物合成。
此外,ET能通过NPR1精确调控拮抗激素SA和JA应答。
泛素介导的蛋白酶水解在ET识别、生物合成和信号传导等多个过程中发挥作用。
尽管PAMPs的识别诱导ET合成的具体机制尚不清楚,但已有的研究表明,PAMPs的识别能激活MPK6,而MPK6能通过磷酸化ET合成酶ACS2和ACS6,阻止ACS2和ACS6被蛋白酶降解。
同样,ACS4、ACS5和ACS9等其他型ACSs也受蛋白水解酶控制。
最近的研究表明,EIN3受MAPK级联反应的调控。
MPK6能通过Thr174对EIN3进行磷酸化,该位点的磷酸化使EIN3更易于被SCFEBF1/EBF2介导的途径降解;
而不依赖MPK6的EIN3中Thr592残基的磷酸化则能保护EIN3不受降解。
由此可ET信号途经与PAMP激发的信号途径之间的交互应答被认为参与乙烯应答元件结合因子ERF104的稳定性调节。
对PAMP鞭毛蛋白flg22的保守肽段的识别能诱导ERF104的磷酸化和从MPK6复合体的释放,从而引起促进ERF104的更新。
另外,ERF104中磷酸化位点的突变能降低其稳定性,也表明蛋白质的修饰对其泛素化和降解至关重要。
四．泛素-蛋白酶体途径与疾病
4．1．在肿瘤发病机制中的作用
泛素-蛋白酶体通路在肿瘤的发病机制中起重要作用。
肿瘤可以起
因于癌基因蛋白/生长促进因子的稳定或由于肿瘤抑癌基因的不稳定。
某些常规通过蛋白酶体降解的癌基因蛋白,如果不能及时地从细胞中清除,就会诱导细胞恶变,如泛素结合的靶目标有N-myc,c-myc,c-Fos,C-Jun,Src及腺病毒EIA蛋白等,而一些抑癌基因的不稳定如p53和p27也已经证实与泛素化降解密切相关。
正常细胞P53是一个半衰期很短的蛋白,它通过Mdm2连接酶作用而经泛素化降解,在某些肿瘤中,常出现Mdm2过表达,从而引起P53降解,细胞基因的异常扩增。
如在高危险病毒株HPV引起的宫颈癌中P53的水平是极低的,体外和体内的实验证明高危险HPV癌基因蛋白E6-16或18可通过HECTE3促进P53泛素化及降解,而低危险株HPVE6-11则不引起P53降解,也不引起细胞转化。
细胞周期依赖激酶抑制因子P27是CDK2/CyclinE和CDK2/CyclinA复合物活性的负调节因子,可阻止细胞从G1期进入S期。
P27也是由泛素介导降解的。
实验表明,在肠癌、前列腺癌及乳腺癌中P27水平降低。
P27的低水平与肿瘤的侵袭性、肿瘤的恶性度、临床分期及不佳预后密切相关。
动物实验证明,肿瘤中SKp2,一种F-box蛋白,水平明显升高,而后者可促进P27泛素化。
其他如VHL基因蛋白的泛素化与肾透明细胞癌有关,BRCA1与乳腺癌的发生有关等。
4.2在囊性纤维化发病机制中的作用
囊性纤维化（cysticfibrosis）是一种先天性常染色体隐性异常的疾病。
实验发现,其致病原因之一是在肺和胰腺组织的腺体上皮细胞膜上有一蛋白,即囊性纤维化跨膜调节因子（cysticfibrosistransmembraneregulator,CFTR）的合成减少。
CFTR是受泛素化调节降解的,当其基因出现某一位点突变如在F508,使CFTR合成变异,从而引起泛素化及降解增强,上皮细胞膜的功能改变并引起囊性纤维化病变。
4.3在神经系统疾病发病机制中的作用
近年来发现泛素系统也与神经细胞变性有关。
如引起帕金森病的一个重要因子是Parkin,后者是泛素和蛋白的E3连接酶,能与E2UbcH7和UbcH8共同作用,而且Parkin自身也是经泛素化调节降解,一旦Parkin变性,影响某些蛋白降解,就会引起多巴胺类神经元的毒性损伤而引起常染色体隐性少年型帕金森病（autosomalrecessivejuvenileparkinsomism）。
在Alzheimer病中神经纤维出现缠结和老年斑,与Tau蛋白磷酸化及泛素调节有关。
免疫和炎症反应、肌肉疾病等都与泛素-蛋白酶体途径有关。
综上所述,泛素-蛋白酶体途径是调节细胞内蛋白水平与功能的重要机制,涉及许多重要的生理过程和许多疾病及肿瘤的发病机制。
近20年来该领域的研究已取得很多令人鼓舞的成果和进展,部分成果已开始应用到临床疾病与肿瘤的预防和治疗上。
但另一方面,仍有大量的问题和机制尚未清楚,有待进一步深入研究。
五．类泛素化修饰Neddylation
NEDD8最初的报道是在小鼠胚胎的脑组织中高度富集的新的mRNA，RNA印迹实验表明NEDD8在发育过程中表达下调．在成人组织中NEDD8在心脏和骨骼肌中特异表达．特异性抗体实验分析检测到NEDD8可表达为6ku单体和与其他蛋白质结合的高分子质量聚合体或NEDD8多聚体．免疫细胞化学实验表明，NEDD8在细胞核中高度表达，在细胞质中表达相对较弱．相对地，泛素在细胞核和细胞质中表达基本一致．NEDD8是由81个氨基酸编码的蛋白质，它和泛素具有60%的一致性和80%的相似性，在酵母和植物中其同源基因被称为Rub1，它可以产生并且连接到少量的细胞内蛋白质上．NEDD8和Rub1的晶体结构已经被解析出来，总体结构与泛素相似，主要的区别仅在两者表面区域具有不同的静电势能面，所以与其他发现的类泛素分子相比，NEDD8的结构与泛素是最为接近的，大多数真核生物（植物、动物、真菌）中NEDD8高度保守，因此NEDD8在真核细胞中具有十分重要的功能．NEDD8
升级会员 