山莓叶挥发油的提取与抗氧化性研究Word格式文档下载.docx

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挥发油与空气及光线经常接触会逐渐氧化变质，使挥发油的比重增加，颜色变深，失去原有香味，并能形成树脂样物质。

挥发油的气味，是中药品质优劣的重要标志。

因此，制备挥发油的方法很重要，产品也应放入棕色瓶内密塞并低温保存［9］。

挥发油为多种类型化合物的混合物，所含化学成分都比较复杂，由十几种到一百多种成分组成，其中有脂肪族化合物、芳香族化合物，更多的为萜类衍生物［10］。

1.2.1.1脂肪族化合物

主要为烃、醇、醛、酮、酯等，广泛存在于植物和水果中，如正丙醇、辛醛、乙酸乙酯、甲酸、辛酸乙酯等。

1.2.1.2萜类化合物

主要为单萜和倍半萜。

不存在多萜（多存在于树脂、色素、橡胶中）。

①不含氧的烃类，占大量，但无香气，非重要成分，如：

α-蒎烯、β-蒎烯、樟烯和月桂烯等。

②含氧衍生物有醇、醛、酮、醚、酚等，含量少，但有香气，为重要成分，如：

芳樟醇、香茅醇、薄荷醇、香茅醛、柠檬醛、1,8-桉树脑等。

1.2.1.3芳香族

除一般芳香含氧衍生物如苯乙醇、水杨酸、水杨酸甲酯等以外，有的是萜类衍生物，如对聚伞花素、百里香酚等，除此之外，大多数为苯丙素的衍生物，其生源可能是通过莽草酸（shikimicacid）途径转化而来，多是具有丙烷基的苯酚化合物及其酯类，如：

茴香脑、丁香酚、α-细辛脑等。

1.2.2挥发油的通性及药理作用

1.2.2.1挥发油的通性

①大多无色或淡黄色，均具有特殊气味（多为香气）与辛辣味，一般室温下可挥发。

②极大多数比水轻，少数比水重（如丁香油、桂皮油等），与水的相对密度为~。

③难溶于水，能完全溶于无水乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油中。

挥发油在水中能少量溶解而使水溶液据具该挥发油特有的香气。

④各种挥发油均具有一定的旋光性和折射率，折射率是挥发油质量鉴定的重要依据，一般在~之间，

⑤多数无确定的沸点和凝固点。

⑥低温时，常有固体物质析出。

1.2.2.2挥发油的药理作用及其研究进展

在古代医疗中挥发油早己经作为药物应用，如桂皮、辛夷、高良姜、茅香、择兰等含挥发油的药材。

作为中药重要的有效成分，挥发油多具有驱风、解热、抗菌消炎医疗作用［11］。

如丁香油有局部麻醉止痛作用;

土荆芥油有驱虫作用;

薄荷油有清凉、驱风、消炎、局麻作用;

柴胡挥发油制备的注射液体，有较好的退热效果;

八角茵香油、山鸡椒油、松节油除药用外，用作重要的化工原料。

筛脑、冰片、薄荷脑、丁香酚、靡香草酚、胡椒酮，癸酞乙醛等已在临床上应用，在香料工业、日用食品及化学工业上也作为重要的原料。

现代应用越来越广泛的芳香疗法指的主要是利用从芳香植物中提取的精油借助按摩、吸嗅、水浴等手段来进行养生、美容及调节情绪的一种疗法［12-13］。

在医疗方面的应用越来越普遍。

其药理作用的研究进展归述如下：

①抗肿瘤作用王翕等人对白术挥发油进行了研究,白术挥发油250mg·

kg-1,灌胃每日1次,连续7d,结果其对小鼠肝癌H22、肉瘤S180的抑制率分别为%和%［14］。

②抗菌作用姜黄挥发油洗剂具有抗石膏样毛癣菌感染作用,其疗效与联苯苄唑比较无显著差异,对感染模型抗真菌作用的总有效率达%［15］。

郭朝晖等人考察了丁香、小茴香、肉桂、八角茴香的挥发油的体外抑菌作用,结果发现4种挥发油对革兰氏阳性及阴性菌均有一定的抑菌作用。

尤其以丁香和八角茴香挥发油含量高,且抑菌效果显著［16］。

③对中枢系统的作用用超临界CO2萃取法从胡椒根中提取的挥发油,对二甲苯所致的小鼠耳肿胀有显著拮抗作用,能明显延长痛阈值时间,减少小鼠自主活动次数,说明其具有明显的抗炎、镇痛、镇静作用［17］。

④对呼吸系统的作用姜黄挥发油可明显增加小鼠呼吸道酚红分泌和大鼠痰的排出量,提示其能促进呼吸道腺体分泌,发挥祛痰作用。

对浓氨水诱发的大鼠咳嗽以及枸橼酸诱发的豚鼠咳嗽,本品均能明显延长引咳潜伏期和减少咳嗽次数,达到镇咳效果。

对组胺诱发的豚鼠哮喘,预先使用,可明显延长引喘潜伏期,具有预防作用［18］。

⑤对平滑肌的作用肖军花等人采用离体子宫肌张力记录法对当归挥发油（AN）及其酸性部位（A1）、酚性部位（A2）和中性非酚性部位（A3）进行了研究。

结果发现AN对正常离体大鼠子宫收缩功能呈双向作用,小剂量（≤20mg·

L-1）略有兴奋作用,大剂量（≥160mg·

L-1）则明显抑制之,较大剂量AN可浓度依赖性地抑制缩宫素诱发的子宫兴奋作用,也可明显抑制高钾引起的子宫收缩。

对正常离体大鼠子宫标本,A1（≤160mg·

L-1）呈兴奋作用,仅在320mg·

L-1才出现明显的抑制作用;

小剂量（≤10mg·

L-1）略有兴奋作用,而大剂量（≥20mg·

L-1）表现为抑制作用;

A2（10~160mg·

L-1）均表现为抑制作用,其IC50为mg·

L-1,抑制效价强度是AN的倍［19］。

⑥驱虫作用桉叶油对蠕形蜻和滴虫均有较强的杀虫作用,随着药物浓度的增加和药物作用时间的延长,虫体死亡率明显升高。

5%桉叶油对中华按蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊均有明显驱避作用,绝对保护时间分别为:

白纹伊蚊170min,中华按蚊和致倦库蚊均为130min［20］。

⑦抗过敏活性甘草根挥发油的主要活性成分甘油草酸能抑制Ⅰ型和Ⅳ型过敏反应,而且挥发油中的其它活性成分β-石竹烯和α-草烯也具有抗过敏活性［21］。

陈皮挥发油具有抗过敏活性,可能是通过抑制过敏介质释放的某个环节或是直接对抗过敏介质而发挥作用。

⑧酶抑制活性挥发油成分对多种酶具有抑制作用。

如（+）-长叶薄荷酮,（+）-香芹酮,（-）-香芹酮,（-）-薄荷酮可抑制乙酰胆碱酯酶活性［22］。

⑨其它作用挥发油除具以上所述的药理活性外,还有许多其它的药理作用。

如华荠苎挥发油能明显抑制轮状病毒、柯萨奇病毒和艾柯病毒［23］;

FerdaCandan等人研究发现.的挥发油具有清除自由基的作用［24］。

1.2.3挥发油的提取方法

由于挥发油的应用越来越广泛，挥发油的提取和分离已成为现在的研究热点，根据参考文献资料显示，现行的挥发油提取方法主要有以下几种：

1.2.3.1蒸馏法

可分为共水蒸馏和水蒸气蒸馏。

共水蒸馏是将植物粗粉加水浸泡后,直接加热蒸馏出水和精油,冷却后,分离出精油。

该法简单方便,但植物原料直接受热,易使精油的某些成分分解并使部分原料焦化,从而影响精油的质量。

水蒸气蒸馏是将植物粉碎后放入蒸馏器中,通入水蒸气,精油随水蒸气一起馏出。

它避免了共水蒸馏的过热或焦化。

水蒸气蒸馏是目前应用最广泛的一种方法,适用于挥发性的、水中溶解度不大的成分的提取。

该方法设备简单、容易操作、成本低。

Boutekedjiret等采用蒸馏的方法对迷迭香精油进行提取,研究表明在各种蒸馏方式中以水蒸气蒸馏操作最为简单,不但可降低香料成分的馏出温度,而且可防止分解或变质［25］。

但是水蒸气蒸馏也存在缺点,即由于操作温度较高会引起精油中热敏性化合物的热分解和易水解成分的水解。

基于水蒸气蒸馏存在的问题,人们开始致力于改进蒸馏设备,从而出现了加压串蒸、连续蒸馏、带复馏柱蒸馏以及涡轮式快速水蒸气蒸馏等形式。

1.2.3.2溶剂提取法

用低沸点有机溶剂如石油醚、乙醚等连续回流提取或冷浸提取，提取液蒸馏或减压蒸馏除去溶剂即可得粗制精油。

该法精油的得率较高,但因植物体中的树脂油脂、蜡等也同时被提出,致使精油含杂质较多,故必须进一步精制。

用有机溶剂提取白术精油与水蒸气蒸馏比较,精油得率高,成分组成一致,主要成分苍术酮提取更完全，溶剂便于回收,是提取白术精油的一种较理想的方法［26］。

但该法成本较高,不宜应用于工厂生产,仅适用于研究工作。

1.2.3.3压榨法

将含精油较丰富的原料（如柑、橘等）粉碎压榨,从植物组织中将精油挤压出来,然后静置分层或用离心机分出油分即得粗品。

由于该法在室温中操作,因此所得挥发油质量好,可保持原有的香味,国外大多采用该法。

但该法所得产品不纯,可能含有水分、叶绿素、粘液质及细胞组织等杂质而呈混浊状态;

同时很难将挥发油完全压榨出来,但可保持精油原有的新鲜香味。

由于该法操作复杂,出油率低,因此不适用于工业生产。

1.2.3.4吸收法

是用油脂、活性炭或大孔吸附树脂等吸附性材料吸附植物的香气成分,再用低沸点有机溶剂将被吸收的成分提取出来的方法［27］。

该法适用于热敏性的贵重挥发油如玫瑰油和茉莉花油的提取,即将新鲜花瓣接触或浸入脂肪（常用无臭味的豚脂3份和牛脂2份的混合物）内，使挥发油完全被脂肪吸收,所得脂肪称为“香脂”,可直接供香料工业使用,也可用无水乙醇处理再将挥发油从脂肪中提取出来。

该法成本较高,但所得挥发油香味纯正。

1.2.3.5酶提取法

是根据植物细胞壁的构成,利用酶反应具有高度专一性的特点选择相应的酶,将细胞壁的组成成分（纤维素、半纤维素和果胶质）水解或降解,破坏细胞壁结构,使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中,从而达到提取目的,且有利于提高提取率。

酶可以在温和条件下分解植物组织,较大幅度地提高收率,是一项很有前途的新技术。

如用纤维素酶处理松针叶提取精油,并以未加酶处理为对照,结果加酶处理针叶精油收率比对照品提高48%。

1.2.3.6微波提取法

是利用微波能来提高萃取率的一种新技术。

微波提取过程中,微波辐射导致植物细胞内的极性物质吸收微波能,产生大量热量,细胞内温度迅速上升,细胞内部压力急剧增大,当超过细胞膜和细胞壁的膨胀能力后,就会导致细胞的破裂,使目标产物流出。

显然，这种作用会使植物目标组分的提取速度大大地增加。

微波辅助萃取（MAE）是近几年发展起来的从天然物中提取香料的一种方法。

该法最大的特点是萃取时间短,产物收率高。

由于微波射线穿透性极好,可施加于任何天然物如银莲花属、锐叶木兰、海藻、地衣以及动物组织如肝、肾、蛋黄等,进而提取有用物质。

国内外学者的研究表明,MAE的优点是节省萃取时间和萃取溶剂,方法已广泛用于有机化学和分析化学制备样品［28-30］。

1.2.3.7超声波提取法

是应用超声波强化提取植物的有效成分,是一种物理破碎过程。

原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分溶出,另外超声波次级效应,如机械震动、乳化、扩散、击碎、化学效应等,也能加速提取成分的扩散、释放并与溶剂充分混合而利于提取。

该法最大的优点是提取时间短、温度较低、收率高。

郑海燕用超声波法提取丁香花中的丁香油,结果表明该方法的收率比水蒸气蒸馏高%［31］。

目前,该法主要用于食品行业及中药有效成分的提取,有广阔的应用前景。

1.2.3.8超临界流体萃取（SFE）法

是引进的一种新型提取分离技术,它利用一种超临界流体（SCF）,如CO2、乙烯、丙烷、丙烯、水等,使其在临界点附近某区域内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性,且对溶质的溶解能力随着压力和温度的改变在相当宽的范围内变动，这种流体可以是单一的,也可以是复合的。

添加适当的夹带剂可以大大增加其溶解性和选择性。

常用的萃取剂为CO2,因其无毒、不易燃不易爆、价廉，其极性类似乙烷。

超临界CO2萃取技术更适合脂溶性、高沸点、热敏性成分,现广泛用于具有挥发性成分的研究。

如用SFE法从芹菜籽、生姜、芫荽籽、茴香、砂仁、八角、孜然等原料中提取精油；

用SFE法提取芳香精油,具有防止氧化、热解及提高品质的优点,如用水蒸气蒸馏法从紫苏中提取精油［32］,会使其特有香味成分紫苏醛受热分解，香味大减,而用SFE法所得芳香精油气味和原料相同,明显优于其他方法。

但由于该法工艺技术要求高,设备费用投资大,在我国应用还不普遍［33］。

1.2.3.9微胶囊--双水相萃取法

是利用被提取物在不同的两相系统间分配行为的差异进行分离,具有较高的选择性和专一性,能提取醛、酮、醇等弱极性至无极性香味成分，应用于精油的提取颇有前景。

一直以来该法主要用于分离生物有机大分子物质,近年来,用该法提取各种小分子有机物也取得了较为理想的效果。

如采用微胶囊--双水相法提取薄荷油、丁香油、柠檬油等,选用环糊精作包裹材料,由于湿球效应,提高了囊心的耐热稳定性,与环境中的水分、氧气及紫外线等不良环境因子隔离,从而避免受其不良影响,能有效地保护目标产物在提取过程中的化学和物理性质指标。

刘品华提出的微胶囊-双水相法,把微胶囊技术和双水相萃取技术相结合用于提取植物精油,能避免提取过程中的高温、氧化、聚合等情况发生,有效地保护精油的天然组分,认为该法应用前景较好［34］。

1.2.4挥发油分析手段

1.2.4.1气相色谱法

利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。

具有分离效率高、多组分同时分析；

分析速度快；

检测灵敏度高；

样品用量少；

选择性好；

可对液体或溶于液体的固体样品进行常量和微量分析和检测；

易于自动化等优点。

在石油、化工、环境、食品（脂肪酸甲酷分析，农药残留分析，香精香料分析，食品添加剂分析，食品包装材料中挥发物质的分析）等许多应用领域发挥着重要作用，也是研究挥发油组成成分的主要方法。

气相色谱主要包括气路、进样、分离和检测系统。

高纯级的载气使检测器的噪声干扰降到最低。

分流/不分流进样可以解决样品进样量大，导致的色谱峰过载问题。

程序升温汽化（PTV）进样就是将液体或气体样品注射入处于低温的进样口衬管内，然后按设定程序升高进样口温度，可除去溶剂和低沸点组分，实现样品浓缩。

分离系统中色谱柱是核心部件，毛细管柱柱效高，分为极性柱、中等极性柱和非极性柱，适用于不同性质的样品。

其中，非极性的HP-5柱主要适合分析生物碱、脂肪酸甲酚、卤代化合物、芳香族化合物、部分药品等复杂的混合物体系。

随着现代气相色谱技术的发展，毛细管气相色谱法（CGC）以高的分离能力、化学及热稳定性高、分析速度快、呈化学惰性等特点而广泛应用于石油化工、环境保护、天然产品、食品等领域复杂有机混合物样品的分析。

GC所使用的检测器有以下几种：

热导检测器（TCD）、火焰离子化检测器（Fro）、火焰光度检测器（FPD）、氮磷检测器（NPD）、电子俘获检测器（ECD）、光离子化检测器（PID）、原子发射光谱检测器（AEo），其中Flo（nameionizationdeteetor）是利用氢火焰作为电离源，使有机物电离，产生微电流而响应的检测器，主要应用于烃类、药物、农药、法医化学、食品和环境科学等领域，进行含碳有机物常规分析，痕量样品的检测［35］。

1.2.4.2GC一MS联用法

质谱法是通过将待测物质的原子或分子在高速电子流等方法的冲击下转变为带正电荷的离子，然后经加速运动形成的离子流在磁场（或同时在电场和磁场）的作用下，按照各种离子的质荷比（m/z）的大小顺序而使其分离开来形成有规律的质谱（MS），并记录其信息，进而对物质组成及其结构进行测试的分析方法。

与气相色谱联用的质谱仪通常用的是连续离子源，如电子轰击电离源（electronimpactionizationsouree，El）;

化学电离源（ehemiealionizationsouree，Cl）。

电子轰击电离方法具有稳定，操作方便，电离效率高，形成的离子具有较窄的动能分散，得到的离子碎片多，结构信息丰富，重现性好等特点，当采用70eV的电离电压时可实现对库谱的检索，是GC/MS最常用的电离源。

当样品的稳定性不高时，可以使用CI电离源。

气相色谱一质谱联用在复杂混合物体系的分离与定性分析中发挥着越来越大的作用，在食品与营养科学领域中，超过一半的研究是通过GC一MS手段进行的。

对挥发油中各组成成分的分离鉴定，可采用气相色谱一质谱一数据系统联用（GC/MS/DS）技术，结合薄层层析一光谱（TLC/SP）联用方法，根据化合物及其衍生物质谱碎片规律解析，与标准图谱检索对照，并参考文献数据一一加以确认，对微量样品的研究，在很短时间内可得出比较好的结果。

此外，全二维气相色谱也开始应用于中药成分分析［36-37］。

由于GC-MS所固有的优点，己成为组成复杂的中草药挥发油体系化学成分分析的最常用手段。

目前对含有挥发油的中药分析研究已有很多相关报道，芸香科植物如降香、花椒、积、吴茱英等；

菊科植物:

如菊、篙、艾、苍术、木香等［38］。

但是，由于精油组分非常复杂，无法采用标准物质逐个组分进行对比鉴定，而且不同气质联用仪器的性能和分离柱柱效存在差异，组分分离效果会不同，这对质谱产生许多干扰因素。

因此，单纯选用质谱检索高匹配度化学结构来确定相应峰的组分存在很大的不确定性。

KovatS保留指数是化学物质在相应类型分离柱中对应正烷烃的一种比较稳定的性质。

只要用于分离的色谱柱性质相同，气相色谱条件相近，同种组分在不同仪器上所计算出来的Kl值通常为常数。

因此，同时考虑分离峰的质谱匹配度和Kl匹配度可大大提高鉴定结果的准确性。

在精油复杂组分鉴定中，该方法在国际上得到普遍认可并大量使用［39］。

抗氧化性研究方法

物质抗氧化作用的强弱，取决于其抗氧化的能力（或称抗氧化活性，antioxidantactivity）。

抗氧化能力的测定方法有许多种，有直接的，也有间接的，还有简便的总抗氧化能力（TAC）试剂盒等［40］。

这些方法都有一定的优缺点或局限性，测定原理各不相同。

常用的测定方法主要有以下几类：

1.3.1过氧化脂质含量的测定

体内不饱和脂肪酸在自由基作用下，可生成脂褐质和过氧化脂质（LP）的最终分解物丙二酸（MDA）。

因此，一般可用MDA和脂褐质的测定来推断脂质所发生的过氧化程度。

1.3.1.1MDA的硫代巴比妥酸（TBA）比色法

MDA是不饱和脂肪酸过氧化反映的最终产物之一，其量的多少反映出LP的程度。

MDA与TBA在酸性环境下加热可形成粉红色复合物，即TBA色素，在532~535nm处有最大吸收峰。

1.3.1.2脂褐质的荧光测定法

脂褐质是老年动物细胞内脂质过氧化的一种产物，能自发荧光，将脂褐质用拥挤提取后可用荧光分光光度计测定其荧光强度，与荧光基准物质比较厚即可求得脂褐质的量。

1.3.2抗氧化酶活性的测定

1.3.2.1超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定［41］

首先在实验体系种建立一个O2—自由基的生成系统，并由指示系统来显示O2—自由基的水平，然后加入待测样品，以求得其抑制O2—自由基的能力。

主要方法有化学发光方法和邻苯三分/VC测定法

1.3.2.2谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的测定

GSH-Px是动物体内一种重要的抗氧化酶，能消除自由基，抑制自由基反映进程，是防止体内自由基所致膜脂质过氧化的重要组分，其活力的强弱可以判断所进食的抗氧化物质的活性强度。

1.3.3羟自由基清除能力的测定（邻二氮菲-Fe2+氧化法）

邻二氮菲-Fe2+是一种氧化还原指示剂，其呈色变化可反映出溶液中氧化还原状态的改变。

通过Fenton反应所产生的羟基自由基，可是邻二氮菲-Fe2+水溶液氧化为邻二氮菲-Fe3+，从而使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，据此可推知系统中羟基自由基的量的变化。

1.3.4DPPH自由基的清除能力

二苯带苦味酰基（DPPH）自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则提示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。

DPPH自由基有个单电子，在517nm处有强吸收，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受试物后，在517nm处可以动态监测其对DPPH自由基的清除效果。

1.3.5总多酚类物质含量的测定（福林-酚比色法）

在碱性溶液中，多酚类化合物可以讲钨钼酸还原（W6+变为W5+）生成蓝色化合物，颜色的深浅与多酚含量呈正相关，蓝色化合物在760nm处有最大吸收，一般用没食子酸（或焦性没食子酸）作为参照标准，提取物中总多酚的含量以等同于没食子酸（garlicacidequivalent）的量表示.

1.3.6总黄酮含量的测定

总黄酮含量一般均以芦丁为参比标准，用分光光度法测定。

黄酮类化合物用甲醇提取后，在碱性条件下与铝盐（三氯化铝或硝酸铝）络合，可呈现红色的络合物反应，然后测定其在510nm处的吸光度，与芦丁标准曲线对照后求得。

研究的主要目的、内容及意义

1.4.1研究的主要目的及内容

本研究主要通过蒸气蒸馏法提取山莓叶中的挥发油成分；

采用气相色谱一质谱联用的分析手段，对提取的山莓叶挥发油样品成品进行分析和鉴定；

通过与抗坏血酸（Vc）及芦丁的抗氧化性进行对比，用DPPH法对山莓叶挥发油的样品进行具体的抗氧化活性的初步研究，为山莓叶挥发油的开发利用提供理论基础参考和科学的依据。

1.4.2研究的主要意义

由于我国山莓野生资源蕴藏量相当大［42］，具有良好的开发价值和应用前景。

而目前对其研究主要集中在资源调查，对其药效成分、药理方面的研究报道很少，尤其是关于山莓叶之药用价值未被重视。

但随着山莓药用有效成分研究的进一步深入，山莓叶的药用价值必将会得到更加充分的重视与利用，所以关于山莓叶的化学成分的研究具有重要的实际意义，它为进一步挖掘山莓的药用潜能，更好的开发利用山莓资源，使资源优势转化为经济优