分离水溶液中卡马西平的分子印迹聚合物的性能评价与应用Word格式文档下载.docx

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卡马西平（carbamazepine,CBZ）是一种用于治疗癫痫与双极性紊乱的常用药物，由于大量使用、高度难降解性、潜在的生物毒性，已成为重要的环境污染物。

研究表明，它存在于污水（高达6.3μg/L）[3]、表面水（1.1μg/L）[3–5]和饮用水（30ng/L）中[3]。

CBZ的难生物降解和不同水域中迁移仍然稳定的性质导致其成为一种高度环境相关药物[6]。

因为它的难生物降解性，有大量方法，例如臭氧化、UV辐照、UV/H2O2降解[7]、TiO2光催化降解[8]已用于从水中去除这个污染物。

然而，当前的高级技术是效率低的，原因是它们优先去除的是浓度高而环境影响小的其它化合物，这就影响了处理费用[9]。

通常，高级处理技术不能完全矿化那些认定的化合物。

所以，CBZ的损失仅部分地归因于处理效率，原因是形成的中间产物更难以降解。

稳定的中间产物可增加处理水的总体毒性并且使环境变坏和产生环境影响[10]。

此外，高级去除方法一般是非选择性的并且增加污水处理费用。

因为CBZ的环境相关性和当前高级去除方法的费用，开发高选择性去除方法是非常有意义的。

分子印迹是一个与分离、人工受体、催化剂、传感器有关的科学研究和工业应用方面迅速生长的领域，原因是分子印迹聚合物（MIPs）具有高度选择性、机械强度，可抵抗酸、碱、有机溶剂的变化并且有耐高压、高温的能力。

分子印迹形可成在形状与化学结构两方面与模板分子互补的选择性识别位点，并且同天然抗体亲和性与选择性相似，这些位点在去除模板之后可与模板分子或者结构紧密相关类似物结合[11]。

此外，MIPs具有稳定、容易制备、价廉的特点，并且可以反复使用多次而不降低性能。

因此，从水溶液中低浓度污染物的去除到分析技术的范围，分子印迹为创造一种具有分子特异性识别性能的聚合物基质提供了一个多方面用途的平台[12]。

水中低浓度污染物的选择性去除是一种具有令人鼓舞的潜在新技术。

α-雌二醇印迹的MIPs被用于从加标湖水中去除雌激素污染物[13]。

LeNoiretal.使用MIP吸附柱从水溶液中去除环境相关浓度的17β-雌二醇[14]。

MIPs也被提及去除酚类雌激素污染物[15]。

还很少有采用MIPs从水样中去除CBZ的研究。

仅有两篇论文报道了使用MIPs从污水中和尿样中选择性萃取CBZ[16,17]。

但是，据我们所知，还没有进行关于吸附容量、CBZ重新结合、模板的机会均等与机会不均等，以及模板泄露等CBZ–MIPs基本材料性质的研究。

也仅有很少的研究企图从相对大体积且低浓度CBZ水体中去除CBZ的报道。

本研究可使MIPs应用于水相尤其是低浓度污水、表面水、地下水中去除CBZ。

本文采用沉淀聚合法合成了MIP。

目标是评价和证实CBZ–MIPs在上述的水溶液中竞争性分离CBZ。

此外，CBZ–MIPs用于实际水样中萃取CBZ并进行HPLC分析。

2.实验

2.1.化学品

CBZ、双氯芬酸（DCF）钠盐、甲基丙烯酸（MAA）、二乙烯基苯80（DVB-80）、2,2’-偶氮二异丁腈（AIBN）,HPLC级乙腈（ACN）、甲醇、甲苯都是购买于Sigma–Aldrich（Steinheim,Germany）。

乙酸和甲酸购自Merck（Darmstadt,Germany）。

AIBN用前在甲醇中重结晶。

分别在甲醇:

水（1:

1,v/v）的混合溶液中和Millipore水中制备CBZ（8g/L）和DFC（4g/L）的标准本体溶液并且在−20℃保存。

2.2.仪器与分析方法

安捷伦1050HPLC（AgilentTechnologies,USA），配置一台79855A21-小瓶自动进样器、一台G1303A真空脱气机、一台79853C可变波长UV检测器、一台79852A四元泵。

UV检测器波长是254nm，柱子温度保持在30℃。

Gemini-NXC18柱（250mm×

4.6mm,i.d.,5μm）用于分离实验。

洗脱条件是先期介绍的[18]。

简单地，梯度移动相含26.5mmol/L甲酸的Millipore水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）。

流速是1.0mL/min。

开始时4min梯度由18%B增加到20%B，随后，3min梯度增加到55%B，5min增加到60%B（保持3min），3min增加到100%B（保持4min），用7min恢复到18%B的初始条件；

将这些条件保持5min以在下次注射前达到平衡。

注射体积是20μL。

样品注射前通过0.45μm注射过滤器（Millipore）。

试验外标法定量CBZ和DFC。

得到的线性范围是0.1到1.0mg/L，偏差系数（R2）是0.9997。

CBZ与DFC的检测限（LOD）是0.01mg/L。

CBZ的LC–MS/MS分析由独立实验室进行，采用的是先期发表的LC–MS/MS程序[19]。

此实验采用一个带真空歧管的BakerSPE12G系统（MallinckrodtBaker,Griesheim,Germany），对水的纯化设备进行模仿。

使用这个SPE仪器进行分离试验。

2.3.沉淀聚合法制备MIP

本研究使用已有的MIP聚合法[20]，仅进行稍微的改进。

简单地，对于CBZ–MIP的制备，在一个250mL旋塞玻璃瓶中，将151mg（0.64mmol）CBZ与0.33mL（3.89mmol）功能单体MAA混合，随后加入50mL致孔剂（乙腈与甲苯的混合物,75:

25,v/v）。

往这个溶液中加入1.82mL（13.06mmol）的交联剂DVB-80和92.5mg（0.565mmol）引发剂AIBN。

将盛有混合物的瓶子置于冰浴中，氮气吹扫5min去除氧气后立即密封。

约2h内，温度从室温到60℃范围变化，将这个温度保持24h并搅拌。

将得到的聚合物用甲醇为溶剂进行索氏提取以去除模板，过滤。

将索氏提取步骤进行若干次，直至滤液中没有CBZ被检测到为止。

于60℃将剩余下来的聚合物在真空下干燥并用于后续的实验。

用同样的方式制备相应的非印迹聚合物（NIP）但不加入模板。

为建立MIP制备程序的可重复性，进行了三批次严格遵循上述程序的聚合过程。

2.4.MIP柱的制备

用干填充法将71mgMIP或NIP置入空的SPE小柱（63mm×

9mmi.d.）中。

用带真空歧管的BakerSPE12G系统迫使溶液以0.15–0.30mL/min的速度通过颗粒物床。

负载样品之前，小柱用5mL甲醇和5mL乙腈预展开，随后用5mLMillipore水以0.1mL/min速度流过。

如果不能立即使用，可将预展开的MIP小柱用适宜的塞子密封并于4℃储存以防因溶剂挥发而干枯。

2.5.MIP的性能

2.5.1.选择性的证实

通过定义为平等和不平等机会竞争吸附的两种不同装载方法对CBZ–MIP的选择性进行评价。

将DCF作为竞争者。

在平等机会竞争吸附实验中，将5mLCBZ与DFC混合物的不同浓度（50,500,1000,2000,4000mg/L）甲醇:

1,v:

v）溶液负载到小柱中。

在不平等机会竞争吸附实验中，将5mLDFC（500mg/L）负载到小柱中，接着是5mLCBZ（500mg/L）溶液。

使用HPLC分析滤液。

所有实验都平行进行三次并取其平均值。

2.5.2.吸附容量

制备一系列的加标水样（从50到4000mg/LCBZ）。

使每份水样（5mL）流过MIP与MIP小柱。

计算吸附效率以评估CBZ–MIP的吸附容量。

所有的实验做平行三份。

2.5.3.装载体积

将1μgCBZ加标的一系列水溶液（100,300,500,700,1000mL）负载到MIP和NIP小柱中。

用5mL的Millipore水洗涤小柱以去除非特异性相互作用，并且用5份1mL每份甲醇洗脱。

用轻微氮气流将萃取液吹脱浓缩至干，在1mL甲醇中溶解，用HPLC分析。

计算CBZ的回收率。

2.5.4.结合性能研究

在每个小柱中以不同的CBZ初始浓度（5–4000mg/L）使CBZ–MIP平衡，并且用一个合适的塞子密封。

2h之后，减压迫使溶液流过颗粒物床。

滤液用HPLC分析。

用同样的方法也测试了CBZ对NIP的结合。

所有的实验进行平行三份。

使用下列方程计算吸附容量：

式中，Q（mg/g）是吸附容量；

V（L）是CBZ溶液的体积；

m（g）是MIP的重量；

C0（mg/L）是CBZ的初始浓度；

C（mg/L）是溶液中CBZ的游离浓度。

2.6.洗脱体积的测定

5mL加标水样（1mg/LCBZ）加载到MIP和NIP小柱之后，用5mLMillipore水洗涤小柱。

将5份（每份1mL）甲醇渗透过小柱。

轻微氮气浓缩萃取液，再次溶解在1mL甲醇中，用HPLC分析。

分别计算每份1mL甲醇的回收率。

2.7.模板的泄漏与MIP的再生性

为了测试模板在水中和有机溶剂中的泄漏，分别将3mLMillipore水和3mL甲醇以0.08–0.10mL/min的速度渗透过MIP小柱。

使用一个单独MIP小柱研究CBZ–MIP的再生性。

用Millipore水和甲醇洗涤小柱数次，直至滤液中HPLC检测不到模板为止。

减压干燥小柱并再次用于CBZ吸附。

通过再生后相同小柱的CBZ回收率测试CBZ–MIP的再生性。

2.8.CBZ–MIP在实际水样中的应用

表面水样收集于柏林夏洛特汉堡托地区的Landwehr运河与柏林SchlossCharlottenburg的一个湖泊。

处理过的污水样品在2009年11月收集于柏林Schö

nerlinde污水处理厂的出水。

全部水样都是用纤维素醋酸酯过滤器滤过，去除任何的固体杂质。

将一升表面水伴随处理过的水样装载到CBZ–MIP小柱中。

将小柱依次用Millipore水和5份甲醇（每份1mL）洗涤。

随后用轻微氮气将萃取液浓缩，再用1mL甲醇展开备HPLC-UV分析。

3.结果与讨论

3.1.CBZ–MIP的性能

3.1.1.选择性的证实

在其它研究之前，为评价CBZ–MIP结合CBZ的选择性，首先进行了机会均等和机会不均等两项竞争实验。

由于DFC分子化学结构一定程度上与CBZ相似（图1），故将DFC选为竞争分子，而且它也与CBZ一起广泛存在于水体中。

在机会均等竞争实验中，DCF和CBZ（浓度是50到4000mg/L）有同样的机会到达结合位点。

因此，DCF能够与CBZ竞争吸附位点。

结果列于图2。

如所料，CBZ在MIP上的吸附效率明显高于它在NIP上的吸附效率，而且CBZ与DFC在NIP上没有选择行为出现。

这表明MIP对CBZ的较高效率与选择性来源于特异性结合位点。

如图2a所示，CBZ和DFC二者在MIP柱中有高吸附效率与较低浓度（50mg/L），原因是在CBZ–MIP上有过量的结合位点。

所以，在这个条件下不存在竞争。

但是，随CBZ与DFC浓度的增加吸附效率降低，并且CBZ与DFC的变化程度存在着差异。

当CBZ与DFC的浓度位于50到500mg/L之间时，CBZ在MIP上的吸附效率轻微地从98.5%降低到83.0%，而DCF的吸附效率从98.3%剧烈降低到6.7%。

结果证实竞争是由CBZ与DCF浓度增加而引发的；

对于机会均等条件，高CBZ浓度的存在，DCF仅稍微吸附在CBZ–MIPs表面。

随着CBZ与DCF浓度的进一步增加，CBZ的吸附效率逐渐下降而DCF的吸附效率保持低下。

这表明结合位点被CBZ饱和，造成负载步骤中过量CBZ和DCF直接流过柱子；

类似的结果被Prasadetal.观察到[21]。

图1卡马西平与双氯芬酸的化学结构式

Fig.1.ChemicalstructuresofCBZandDFC.

对于机会不均等竞争，首先将DCF负载到柱子中，以便在随后加入CBZ之前，使DCF有到达或占据结合位点的机会。

如果CBZ对CBZ-MIP的结合亲和性弱于先期吸附的DCF，则CBZ就会随滤液流出柱子。

有趣地，加载CBZ之后MIP对DFC的吸附效率急剧下降，而DCF在NIP上的吸附效率没有明显改变（图2b）。

结果表明，吸附的DCF被CBZ代替，原因是MIP对CBZ的较高分子识别选择性。

图2不同负载方法的CBZ与DFC在MIP和NIP上的吸附:

（a）CBZ与DFC的机会均等竞争,（b）CBZ与DFC的机会不均等竞争.

Fig.2.AdsorptionofCBZandDFConMIPandNIPwithdifferentloadingmethods:

（a）equalopportunityand（b）unequalopportunitycompetitionbetweenCBZandDFC.

机会均等与不均等竞争实验证实了两个重要的推断。

第一，MIP吸附位点对于高浓度模板分子而不是其它环境污染物一般是特异性的。

这使得模板分子优先占据有限的结合位点，尤其是在来自模板化合物生产厂的污水或特定废水的应用。

第二，模板和其它环境污染物处于相对低浓度时，MIP吸附位点先被模板化合物占据，而过量的吸附位点被其它污染物占据（竞争化合物）。

模板和其它污染物的量随水样体积的增大而增加。

因为MIP的高选择性，在开始时吸附的竞争化合物被模板分子代替，直到这些结合位点被模板分子占据，此时这个材料完全被负载。

先期研究曾经提出选择性机理[22,23]。

MIP结合位点的结构分析是困难的，原因是这个材料的不定型性质与结合位点结构的非均相分布。

Liuetal.证实，除了目标分子与结合位点之间相互作用的强度之外，空穴的形状与尺寸决定着MIP的选择性[22]。

Simonetal.在结构-结合的相关研究中采用分子探针评价了结合位点结构[23]。

他们的研究结果说明了预组合概念和形状选择性在预报MIPs的行为方面是重要的。

通过对较少模板-功能单体相互作用的模板诱发的MIP印迹效果可发现形状选择性是选择性的一个主导机理。

另外，MIP（含大量功能单体）对模板的选择性依赖于功能单体的预组织。

3.1.2.吸附容量和装载体积

吸附容量和加载体积是两个表征MIP吸附床的重要参数。

吸附容量表征可以被加载到吸附剂床的未被损失分析物溶质量，而加载体积指的是在给定水力学条件下可被引入到吸附剂床的水样最大体积。

当达到吸附剂床的穿透阈值时则穿透发生[24]。

对于一个给定的填充床，吸附剂容量和加载体积在测定吸附参数（例如吸附剂量和床厚度）方面是有价值的[25]。

吸附容量相应的是平衡时停留在某个MIP上的化合物最大量。

本文进行了简单的吸附剂容量的研究，以弄清楚有效地停留CBZ而不使活性位点过载的CBZ–MIP的容量。

图3给出了MIP与NIP的吸附效率。

很明显，MIP比NIP吸附了更多的CBZ。

CBZ浓度为100mg/L时，它在MIP与NIP上吸附效率的差异高达70%以上。

CBZ浓度为50到100mg/L时，MIP对CBZ的吸附效率大约是98%；

洗涤可能造成CBZ的损失。

CBZ的Kow是2.45，属中等极性或弱极性。

在本文中，用碱性Millipore水洗涤后有少量的CBZ从MIP柱中损失，这可能由疏水相互作用引起。

当CBZ浓度增加到500到1000mg/L时，MIP对CBZ的吸附效率从90%降低到80%。

当CBZ浓度从1000增加到2000mg/L时，吸附效率急剧下降。

这表明在这个浓度范围所选定的吸附剂存在一个饱和点。

图3不同浓度的CBZ在MIP和NIP上的吸附

Fig.3.AdsorptionofCBZonMIPandNIPwithdifferentCBZconcentrations.

进行了累积加载实验以确认所选择的吸附剂床是否在上述分析的基础上达到了饱和点。

5种相同体积（5mL）与相同浓度（2000mg/L）的溶液被连续加载到MIP柱中并收集每个加载步骤的滤液。

根据此结果，当第一个5mL溶液通过MIP柱时，结合到吸附剂床的CBZ百分数是58.3%，这高于其它4个批次加载步骤（被保留的百分数是9.8%到3.9%）。

这表明吸附剂接近饱和。

然而，后续加载中有额外少量的CBZ吸附在MIP上。

这可能是由某些难到达结合位点的缓慢动力学引起的。

此外，聚合物较长时间暴露于有机溶剂（甲醇）可能发生溶胀现象，这也可能暴露结合位点[26]。

高加载体积可预防在一些选择性小柱发生的加载和洗涤步骤中转移样品带来的损失。

5个不同体积（100,300,500,700,1000mL）但含相同CBZ量（1μg）的样品渗透过MIP和NIP小柱；

结果列于图4中。

CBZ在MIP小柱中的回收率保持在81%到97%之间，明显高于NIP小柱的回收率。

伴随样品体积增加，NIP小柱的回收率从39%降低到7.2%。

结果证实，MIP的容量很高，甚至在低浓度下足以取得近乎完全的吸附，而在较低的初始浓度下NIP的回收率降低。

此外，很明显看到在大体积且低浓度（1000mL,1μg/L）下，MIP具有较好的去除率。

本文的结果提供了MIP应用于水相，尤其是废水、表面水、自来水中低浓度CBZ重新使用的重要前景。

MIP去除酚类也发现了类似的结果[15]。

图4不同加载体积下的CBZ在MIP和NIP上的吸附

Fig.4.AdsorptionofCBZonMIPandNIPwithdifferentloadingvolumes.

3.2.CBZ–MIP的结合性能

对于吸附过程理论的了解与吸附材料的优化，CBZ在CBZ–MIP上的结合等温线是有用的。

评估吸附剂的吸附性质，例如结合亲和性和吸附行为，这是一个重要的内容。

据悉，Freundlich等温线（方程式2）是MIP较好的模型[27–30]。

式中，Q（mg/g聚合物）是吸附容量；

a与n是吸附系数；

C（mg/L）是溶液中游离CBZ的浓度。

水溶液中CBZ结合等温线列于图5。

终CBZ浓度为4000mg/L且使用71mg吸附剂时，MIP对CBZ最大结合位点容量是86mg/g。

Freundlich吸附模型成功描述了吸附等温线（R=0.998）（图5b）。

图5CBZ在MIP上与NIP对CBZ的吸附等温线:

（a）没有拟合曲线的吸附等温线,（b）有Freundlich模型拟合曲线的吸附等温线.

Fig.5.AdsorptionisothermsofCBZonMIPandNIPforCBZ:

（a）adsorptionisothermswithoutthefittingcurveand（b）adsorptionisothermswiththefittingcurvebytheFreundlichmodel.

观测的MIP结合经常是基于特异性与非特异性相互作用[31]。

由于有固定尺寸、形状、结合位点，以及目标分子与位点间特异性作用的记忆空穴的存在，MIPs对于模板分子是特异性的。

特异结合起源于印迹过程并且发生在对模板的选择性识别位点。

这表明MIP的印迹空穴可能是模板对聚合物的高度结合亲和性的原因。

为了研究是否聚合反应可创造特异性识别模板的CBZ印迹位点，我们比较了一个MIP与一个NIP。

根据MIP再容纳CBZ能力，评估了MIP高于NIP的特异性。

如图5a所示，二种吸附剂的吸附容量随CBZ浓度的增加而增大，但CBZ–MIP的吸附容量远大于NIP。

这结果与Bravoetal.的结果一致[32]。

在CBZ浓度为4000mg/L时，MIP与NIP对CBZ吸附容量的差异大约是60%。

本研究的结果显示MIP模板的存在非常敏感。

不存在印迹时，再结合单独由疏水结合所驱动。

相应的对照聚合物未能在分析物之间进行区分，这表明印迹现象对识别性质负责。

然而，NIP也能够结合一定量CBZ，这表明MIP也有可能通过非特异性结合作用吸附CBZ[33]。

由于CBZ和MIP表面的强疏水性质，疏水作用也有助于相对高的吸附容量[27]。

3.3.解吸过程中的洗脱体积

理想的样品洗脱方法学应该是快速、准确、精确的，应消耗很少的溶剂。

为减少甲醇消耗，洗脱尝试用5mL甲醇。

单独计算每份1mL甲醇的回收率。

如图6所示，MIP和NIP二者证实了第一个1mL甲醇高百分数的回收率，其它4份甲醇达到一个平台。

第一个1mL甲醇通过柱子后，CBZ在MIP柱上的回收率达到88.3%。

第二份甲醇的回收率仅是10.5%。

结果表明，对于MIP选择量的CBZ，1–2mL甲醇完全足够将CBZ洗脱，因而对工业应用具有特别的意义。

图6不同洗脱体积下MIP与NIP对CBZ的回收率

Fig.6.RecoveriesofCBZusingMIPandNIPwithdifferentelutionvolumes.

3.4.模板的泄露与MIP的再生性

MIP是用大量模板合成的，这可能造成萃取后有少量模板分子残留在聚合物中并且在后来的吸附与解析过程中发生泄露。

模板化合物的泄露可能削弱检测目标物质的准确性与精确性。

这在一些情况下有发生[27,34]。

对于我