参考临床分离产头的孢菌素酶阴沟肠杆菌的耐药性研究Word文件下载.docx
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型金属B一内酰胺酶由染色体介导.u酶为亚胺培南可诱导的
金属酶,能水解包括亚胺培南在内的几乎所有B一内酰胺类抗生
素,且不被常规B一内酰胺酶抑制剂所抑制,因而临床治疗嗜麦
芽窄食单胞菌所致感染非常困难4.本研究将L1型金属B一内
酰胺酶基因克隆至原核表达载体pET_41a（+）,经IPTG诱导表
达6h后可大量获得该酶的融合蛋白.菌株710所产L1酶的氨
基酸序列与国外同类酶的最高同源性仅为92.44%,故该酶进
化速度较快,推测该酶的异质性可能与抗生索的选择性压力有
关.
抗生素对Ll的酶稳定性结果显示氨曲南对金属酶L1表
达产物高度稳定.L1酶能快速水解青霉素及碳青霉烯类,对头
孢菌索而言,第一代头孢菌素头孢唑林的水懈效率最高,稳定
性最差,头孢他啶与LI酶的亲和力最小,水解速度最低,故酶
稳定性最好.
本实验对Ll型金属B内酰胺酶的克隆测序及成功表达为
进一步研究该酶的分子生物学特性奠定了基础.U酶的动力
学研究为指导临床合理应用抗生索提供了科学的理论依据.
参考文献
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trialHeterogeneityofthe1Aand1213-[.actam&
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8:
193—2oo
余娴,凌保东’,周岐新,雷军,谢勇恩
（川北医学院药物研究所,南充637007;
重庆医科大学药理教研室,重庆400016）
捅要目的:
研究我院产头孢菌素酶（AmpC酶）阴沟肠杆菌的检出率,耐药情况厦ampC基因型.方法:
收集临床分离的耐
药阴沟肠杆茸15株;
三维试验检测AmpC酶;
NCCLS方法检测超广谱p一内酰胺酶（ESBLs）;
琼脂二倍稀释法测定MIC值;
PCR扩增
检测ampC基因及序列测定.结果:
15株菌中8株茵（s3,3%）产AmpC酶,3株茵（2O.O%）产ESBLs.产AmpC酶的茵株除对亚胺
培南全敏感外,对其它抗茵药不同程度耐药.5株菌的ampC基固与阴沟肠杆菌ECLC074的ampC基因100%同源,3株茵与-~99%
同源.2株茼的AmpC酶发生了1个氨基酸残基的改变结论:
产AmpC酶是阴沟肠杆菌对B.内酰胺类抗生素耐药的主要机制之
一
.阴沟肠杆茼ECLC074ampC基因是我院主要的阴沟肠杆菌ampC基因型.产AmpC酶的阴沟肠杆菌常呈多重耐药,亚胺培南是
治疗此类菌所致感染的最有效药物.
关键词阴沟肠杆菌;
头孢菌素酶;
ampC基因;
耐药
基金项目:
四川省重点科枝攻关项目（编号02SG022～030）
四川生理科学杂志2005;
27（4）157
阴沟肠杆菌是一种重要的条件致病菌,随着新的B呐酰胺
类抗生素广泛应用于临床,此类菌的耐药问题越来越受到人们
的关注.细菌通过产生大量的由染色体或质粒介导的B一内酰
胺酶（Bla）可使抗生索失活,包括头孢菌素酶（AmpC酶）,超广
潜B一内酰胺酶（ESBLs）,碳青霉烯酶等.AmpC酶由ampC基因
编码,常见于阴沟肠杆菌,枸橼酸杆菌,摩根摩根菌,粘质沙雷氏
荫等为明确本地区医院感染阴沟肠杆菌的耐药机制,指导临
睐台理使用抗菌药,本文对产AmpC酶的阴沟肠杆菌的耐药表
型和ampC基因进行初步研究.
l材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株川北医学院附属医院2003年2月至2004年1
月分离的耐睬拉西林阴沟肠杆菌l5株,经梅里埃vitek32细菌
鉴定系统鉴定E.coliJM109由四川大学华西基础医学与法医
uz,,0,--感染免疫研究室提供.标准质控菌株大肠埃希氏菌
ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC700603由四川抗菌素工业研
究所提供.
l…12主要试剂哌拉西林（齐鲁制药厂）,哌拉西他唑
巴坦（上海先锋药业公司）,头孢哌酮,头孢哌酮/舒巴坦（哈药
集团制药总厂）,头孢他定,头孢噻肟（哈尔滨誉衡药业有限公
剥）,氨曲南,头孢吡肟（中美上海施贵宝制药有限公司）,亚胺
堵南（美国默沙东药厂）,头孢西丁（海南轻骑海药股份有限公
刊）,AMK（江苏吴中实业股份有限公司）,加替沙星（南京圣和
药业赠）,环丙沙星（中国药品生物制品检定所）.头孢他定/克
拉维酸纸片,头孢他定纸片,头孢噻肟/克拉维酸纸片/头孢噻肟
纸片,头孢西丁纸片购于北京天坛药物生物技术开发公司.
DNA凝胶回收试剂盒购于V—gene生物技术有限公司.基因组
小量抽提试剂盒购自上海Sangon生物工程技术有限公司.
pMDl8一TVector购于TaKaRa公司
l1.3主要仪器SakumaMIT-P细菌多点接种仪,MJRe—
searchPTC150型PCR仪,GDS2000多功能凝胶成像和分析系
统.
1.2方法
1.2.1Bla粗提液的制备及Bla的定性检测超声破碎法制
备,Nitrocefin进行酶的定性检测.
1.2.2AmpC酶的检测通过三维试验…判断是否持续高
产AmpC酶.
1.2.3ESBLs酶的检测根据2002年NCCLS的规定进行.
1.2.4药敏试验采用琼脂二倍稀释法.根据2002年NC—
L:
Ls的标准判断.
I.2.5基因组DNA的提取使用基因组小量抽提试剂盒,按
说明操作.
1.2.6设计引物及PCR扩增检测ampC基因
根据已知的阴沟肠杆菌ampC基因序列,设计引物
PI:
5gactgctattacggaag一3
P2:
5ttactg【agcgcctcgag-3
引物由上海Sangon生物工程技术有限公司合成.以基因
组DNA为模板扩增ampC基因.PCR扩增条件为:
94%3min,
55.（:
lmin,72℃1rain,共30个循环,最后72’U延伸7min.扩增
产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测
1.2.7ampC基因PCR产物的回收,TA克隆及重组质粒的酶
切鉴定PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,切下目的带,
用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA.取3回收DNA与含氨苄
西林抗性基因的pMD18一TVector连接,连接反应液转化至经氯
化钙制备的E.coliJM109感受态细胞,经含氮苄西林的LB培
养基进行蓝白斑筛选.挑取白色菌落,过夜培养后,提取质粒经
EcoRa和HindⅢ双酶切鉴定.
1.2.8扩增产物的序列测定及同源性分析转化菌送上海基
康生物公司进行DNA测序,测序结果在GenBank上用BLAST
进行同源性检索分析.
2结果
2.1Bla的定性检测所试菌均产Bla.
2.2AmpC酶的检测结果所试菌中8株菌持续高产AmpC
酶,检出率为53.3%.
2.3ESBLs的检测结果所试菌中3株（20.0%）产ESBLs,8
株产AmpC酶的细菌均不产ESBLs.
2.4MIC测定结果8株产AmpC酶的细菌对第三代头孢菌
素,头孢西丁及氨曲南完全耐药,对哌拉西林/他唑巴坦,头孢哌
酮/舒巴坦,头孢吡肟的耐药率分别为25.O%,50.O%,50.O%,
对亚胺培南无耐药株,1株菌对阿米卡星耐药,1株菌对环丙沙
星及加替沙星敏感（表1）.
表1抗菌药对8株产AmpC酶阴沟肠杆菌的抗菌活性
PIP噘拉林,PIWTB哌拉西料_√他唑巴坦,CPZ头孢哌l酮,CP7JSB头孢哌
酮/舒巴坦,CAZ头孢他定,cTX头_尥嚷肟,CPE头抱吡肟,FOx头孢西丁,AZ氧曲
南,IMP亚胺培南,AMK阿米卡星,CPLX环丙沙堪,GTI,x加替沙星
2.5PCR扩增检测ampC基因产AmpC酶的8株菌扩增出
约1lOObp的阳性扩增带（图1）.
bD
2000
1000
750
500
250
lOO
M:
DNAmolecularweightmarker
I,8:
thePCRproductsofampCgene
l圭j18株阴沟肠杆菌atnpC基因PIt产物电泳圈
2.6ampC基因核苷酸序列及氨基酸序列分析扩增产物经
TA克隆后测序得知,8株菌的ampC基因为1146bp,与阴沟肠杆
菌ECLC074的ampC基因核苷酸序列（I146bp,注册号
AY536040）及氨基酸序列对比分析（图2）,5株菌与其核苷酸序
列100%同源,其余3株菌与其核苷酸序列99%同源.其中,阴
158四川生理科学杂志2005;
沟肠杆菌3-5t的ampC基因核苷酸序列发生了5个位点的同义
突变;
阴沟肠杆菌394的舯c基因核苷酸序列在506位发生
T一C的异义突变;
阴沟肠杆菌3-t07的ampC基因核苷酸序列
发生了2个位点的同义突变和1个位点的异义突变（表2）.
1MMKKSLcCALLLGlscSALA2u
21rPVSEKQLAEVVANTVrPLMKAQSVPGMAVAVIYQGKPHYYT}~,KADIAA70
71Nl（Pv1LLGlsIsKl盯…GVLGGDAIARGE1SIDDPvTRYwPQI:
IX;
KQ120
121WQGIRMLDLATYTAGGLPLQVPDEVTDNASLLRF1YQNIWQPQWKPGFFRIYl70
17lANASIGLFGALAVKPSGMPYEQAMTrRV!
KPIKI.DHTwlNVPKAEEAHYA220
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Theamilmacidsequencefrom】to20i8a88ullJedtobcthesignalpeptide（underlined）.
TheimFortmttmgiomofAtnl~13-Isettunasemb0xed.
图2阴沟肠杆茼ECI|c074AmpC酶的氨基酸序列
表2Ecl3,51,Ecl3-94,Eel3—107与ECLC074的ampC基因及AmpC
酶的差异性
“
“示此位点无突变发生
AmpC酶属Bushl型Bla,能水解第三代头孢菌素,不被克
拉维酸抑制.一般情况下,阴沟肠杆菌未接触B一内酰胺类抗生
素时,AmpC酶呈低水平表达,但能在具有诱导力的p-内酰胺类
抗生索（尤其是IMP,FOX）的作用下诱导产生;
电可因调控基因
ampR,ampD等高白发性突变使ampC基因去阻遏,从而持续大
量的产生.近年来法国,美国,巴西”等西方国家报道了
由产ESB阴沟肠杆菌引起的医院感染,从而说明产生ESBLs
是造成该类菌对B-内酰胺类抗生索耐药的另一重要原因.木
实验中,产AmpC酶菌的高检出率（53.3%）说明产AmpC酶是
本地区医院感染阴沟肠杆菌对B-内酰胺类抗生素耐药的主要
机制.3（20.O%）株菌产ESBLs,可见产生ESBLs是该类菌的另
耐药机制.8株产AmpC酶阴沟肠杆菌的舯pc基因与阴沟
肠杆菌ECLC074的ampC基因高度同源,说明本院产AmpC酶
阴沟肠杆菌的ampC基因起源于阴沟肠杆菌ECLC074的ampC
基因,此基因是该类菌的主要基因型,携带此基因的阴沟肠杆
菌可能在院内流行.与阴沟肠杆菌ECLC074的AmpC酶氨基
酸序列相比,2株阴沟肠杆菌的AmpC酶发生了1个氨基酸残
基的变异,但丝氨酸Bla所共有的活性结合位点SXXK,AmpC
酶的特征性结构YXN,KTG-o以及ThrT0j均未发生变化.要
明确AmpC酶氨基酸残基的变异是否影响其水解底物的活性,
有待进一步探明.
药敏试验显示产AmpC酶阴沟肠杆菌对哌拉西彬他唑巴
坦,头孢哌酮/舒巴坦,头孢毗肟,亚胺培南以外的B一内酰胺类
抗生素完全耐药.以往认为第四代头孢菌素头孢吡肟可用于治
疗高产AmpC酶细菌引起的感染,但本实验发现50.O%该类菌
对头孢毗肟耐药,耐药机制显然与高产AmpC酶有关.AmpC
酶时B.内酰胺酶抑制剂不敏感,而实验中B-内酰胺酶抑制剂不
同程度降低了产AmpC酶阴沟肠杆菌的耐药率,未发现此类细
菌产ESBLs,说明部分细菌同时产生对B一内酰胺酶抑制剂敏感
的其它Bla如广谱酶,青霉素酶等.对亚胺培南无I菌株耐药
提示碳青霉烯类抗生素在治疗高产AmpC酶菌引起的感染中发
挥着重要的作用.阿米卡星对产AmpC酶阴沟肠杆菌的耐药率
为125%,显示阿米卡星是治疗该类细菌所致感染的有效药
物,此和国内的其它实验报道一致..产AmpC酶阴沟肠杆
菌对FQNS呈现高度耐药,表明该类细菌同时存在耐FQNS的
机制,其机制是细菌DNA螺旋酶的改变,外膜渗透性降低或是
药物的主动外排,需进一步探讨.
由此可见,多重耐药现象,多种耐药机制普遍存在于阴沟肠
杆菌,给临床治疗带来了困难.因此临床医生应提高警惕合理
使用抗菌药,以有效治疗及控制耐药菌的感染并延缓新型耐药
菌的出现及扩散.
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（‘InstituteofMatel’iaMedicainNorthSichuanMedicalCollege,Nanehong,637007;
Pharmac.1.gYDepartment.fCh.ngqinguniversityof
MedicalScience,Chongqing400016）
ABSTRACTObjective:
Tostudythedetectionrate,theresistancephenotypesandtheampCgeneofcephalosporin（AmpC）3-lac—
tamase—producingEnterobactercloacaeisolates.Methods:
15randomlychosenpiperaci~in.resistantEnterobactercloacaewereisolated.
AmpC3-lactamaseswereexaminedbythreedimensiontest.Extendedspectrum3-lactamases（ESBLs）weretestedaccordingtoNCCLSTest.
MICsofantibactefialsweredeterminedbytwo—foldagardilutionmethod.ampCgeneswereamplifiedbyPCRandPCRproductswerese—
quenced.Results:
Of15Enterobactercloacae,8（53.3%）isolatesproducedAmpC13-1actamasesand3（20.O%）producedESBLs.
AmpCB—lactanmse—producingisolatesweresusceptivetoimipenem,whiletheyhadthe出fferentresistantratestotheotherantibacterials.
ComparedwithEnterobactercloacaeECLC074ampCgene,theampCgenesof5strainshad100%homology,
andthoseoftherest3strains
had99%homology.AmpCB-lactamasesof2strainshadoneaminoacidresiduemutagenesis.Conclusion:
ProductionofAmpCB—lactamas—
esisoneofthemainresistantmechanismsofEnterobactercloacaeto13-1actamantibiotics.EnterobactercloacaeECLC074ampCgeneisthe
maingenestyleofAmpC13-laetamases-producingEnterobactercloacae.AmpC3-lactamase-producingEnterobaetercloacaeisolatesaremulti.
dlgresistantfrequently.Imipenemistheappropriateantibioticforthetreatmentoftheinfectionscausedbythiskindofstrains.
KeywordsEnterobactercloacae;
AmpC13-1actamase;
ampCgenc;
resistance
乙酰二脱水卫矛醇对L1210
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