藻胆体与藻胆蛋白研究进展.doc

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藻胆体与藻胆蛋白研究进展

摘要：

蓝藻和红藻中的藻胆蛋白通过连接多肤将不同类型的藻胆蛋白按照一定的次序组合在一起,形成高度有序的超分子复合体-藻胆体,存在于光合膜的表面,作为光合作用能量吸收与传递的功能单位。

藻胆体分子量的范围介于7x106至15×106道尔顿之间,形状及大小与藻的种类密切相关。

【1】外藻胆蛋白的分离纯化主要包括提取原料、细胞破碎法和分离纯化3个方面。

藻胆蛋白其生物活性主要表现在:

抗肿瘤活性、抗病毒活性、抗氧化和消炎活性,提高免疫活性。

关键词：

藻胆体，藻胆蛋白，分离纯化，超分子结构，能量传递，藻胆体-类囊体膜的天然架构，能量耗散机制

1简介：

1.1藻胆体

藻胆体是由多种藻胆蛋白和连接蛋白组成的超分子蛋白复合物，含有数百个开链四吡咯发色团，分子量高达几百万道尔顿。

【2】藻胆体是红藻及蓝藻中的主要捕光天线，蓝藻和红藻通过附着在类囊体膜表面的藻胆体作为捕光复合物捕获光能并将其传递到光反应中心。

藻胆体主要有半球形和半椭圆形两种。

捕获光能并高效的传递给光反应中心PS2，种种传递给中心PS1。

PS1,PS2,PBS都在类囊体膜上，其形式与高等植物不同，光合作用过程，特别是光反应过程，是由类囊体膜上的超分子复合物实现的。

【3】藻胆体可以分为两部分：

核心部分－主要由别藻蓝蛋白（APC）构成；杆状复合物－主要由藻蓝蛋白（PC）和藻红蛋白（PE）或藻红蓝蛋白构成。

【8】

1.2藻胆蛋白

藻胆蛋白主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中,其主要功能是作为光合作用的捕光色素复合体。

细菌、藻类和高等植物的光合作用的共同特征是具有很多"天线分子"，这些"天线分子"吸收光能并通过非放射性过程将激发能传递到含有叶绿素的"反应中心"，在红藻、蓝绿藻和隐藻中，藻胆蛋白就充当这种"天线分子"的角色。

因此，最初的藻胆蛋白研究主要集中在探讨其光合作用意义。

近年来发现，藻胆蛋白在食品、化妆品、医药以及生物工程领域具有广阔应用前景。

在一些藻类中藻胆蛋白也可以作为储藏蛋白,以使藻类在氮源缺乏的季节得以生存。

2藻胆体的分类和分布

已知的藻胆体主要有以下几种:

（1）束状藻胆体,这种藻胆体是由六根直径为10一12nm,长度为50一70nm的“杆”所组成,每根“杆”均与细胞膜内表面成固定的角形成了状似倒立三角烧瓶的束状结构。

束状结构的基部是一个性质与组成还不太清楚的圆盘形结构,藻胆体通过这个“圆盘状结构”与细胞膜内表面结合。

这种藻胆体仅在一种特殊类型的蓝藻Gloeobacterviolaceus中发现,这种蓝藻没有类囊体结构,所有的合作用蛋白质复合物存在于细胞膜内或者细胞膜内表面上。

（2）半盘状藻胆体,这种藻胆体存在于蓝藻和一些单细胞红藻中,是最常见的一种藻胆体。

它由“核心复合物”和“棒状复合物”二部分组成。

“核心复合物”是由三个圆柱体组成,每个圆柱体的直径大约为lnm,长度约为12nm。

在“核心复合物”外周沿同一平面有六个“棒状复合物”呈扇形排列,每个“棒状复合物”是由2一6个盘状物垛叠而成,每个盘状物的厚度为6nm,直径为1一12nm。

（3）半椭球形藻胆体,这种藻胆体主要存在于一些高等红藻和蓝藻中,紫球藻的藻胆体也是属于这种类型。

第一个被发现的藻胆体就是紫球藻藻胆体,所以这种藻胆体研究得最深人它的大小为40xl9x28nm,,也是由“核心复合物”和“棒状复合物”二部分组成。

大约10一12根“棒状复合物”呈放射状排列在“核心复合物”外周。

（4）双圆桶状（Bieylindrieal）藻胆体,这种藻胆体仅在红藻Griffithsiapacifica发现,它的大小大约是63x38×38nm。

用不同光质的光处理蓝藻Phormidiumsp.C86细胞可以诱导产生两种不同类型的藻胆体。

在红光下生长的细胞中可以分离得到半盘状藻胆体,这种藻胆体的异藻蓝蛋白与C一藻蓝蛋白的摩尔比为1:

4.5,但不含藻红蛋白;而在绿光下,胞中的藻胆体则变为半椭球形,藻胆体的异藻蓝蛋白、C-藻蓝蛋白和藻红蛋白的摩尔比为l:

1:

6.8,其主要组分是藻红蛋白;当细胞生长在白光下时,则既有半盘状藻胆体,也有半椭球形藻胆体,而且还有介于二者之间的“中间类型”存在。

研究表明,在许多藻类中,藻胆体“棒状复合物”的组成往往与培养条件有关,这些培养条件包括光强、温度、Cq浓度和氮源等。

根据不同光质下,细胞内藻胆体组分的变化,可将蓝藻分为三大类,

（1）在任何光质下,藻胆体的组分均不发生变化;

（2）在不同光质下,细胞内仅藻红蛋白的表达有差异,其它组分不变;（3）在不同光质下,藻红蛋白和藻蓝蛋白的相对浓度发生变化,例如细胞生长在红光下,可以诱导藻蓝蛋白的积累,而使藻红蛋白含量减少;如果细胞生在绿光下,藻胆蛋白相对含量的变化正好与红光相反。

【1】

3藻胆体的组分和结构特性

3.1藻胆体组成

藻胆体可以分为两部分：

核心部分－主要由别藻蓝蛋白（APC）构成；杆状复合物－主要由藻蓝蛋白（PC）和藻红蛋白（PE）或藻红蓝蛋白（PEC）构成，不同的藻胆蛋白分子间依靠连接多肤相互连接。

3.2藻胆蛋白分类

已知的藻胆蛋白主要可以分为以下４大类：

1，藻红蛋白（Phycoerythrin,PE）2、藻蓝蛋白（Phycocyanin,PC）3、藻红蓝蛋白（Phycoerythrocyanin,PEC）4、别藻蓝蛋白（Allophyxoxyanin,APC）。

红藻中的藻红蛋白和藻蓝蛋白分别被称为RPE和RPC，蓝藻中的藻红蛋白和藻蓝蛋白分别被称为CPE和CPC。

3.3连接方式

“棒状复合物”是由C一藻蓝蛋白（CPC）和4种连接多肤所组成。

这个棒状复合物的分子排列次序为:

LR9一CPC-LR30一CPC-LR33一CPC-LR27“核心复合物”LR9的主要功能在于它能保持“棒状复合物’长度的均一性,它的结合位点可能是CPC-LR30复合物中远离“核心复合物”的那一端。

在体外纯化的连接多肤可与藻蓝蛋白六聚体形成复合物,甚至可形成聚集体。

同时还发现连接多肤可使藻蓝蛋白的吸收光谱和荧光光谱红移,而且离“核心复合物”越远,连接多肤和藻蓝蛋白复合物的光谱红移程度越大,这种逐步红移现象有利于分子间的能量传递。

连接多肤仅在决定“棒状复合物”长度方面起重要的作用,对藻胆蛋白的光谱特性影响较小。

同时连接蛋白在决定藻胆体“棒状复合物”的生物组装方面也起着重大的作用。

到目前为止，多种藻胆蛋白的晶体结构已经得到解析，藻胆蛋白由两种亚基（α和β）组成，圆盘状，中央有一空洞。

三聚体（αβ）3，圆盘直径11nm，孔径6nm，厚度3nm；六聚体（αβ）6,圆盘直径11nm孔径6nm，厚度6nm。

“核心复合物”通常是由三个圆柱体构成。

每个圆柱体主要是由三聚体的异藻蓝蛋白（APC）和连接多肤组成。

连接蛋白是连接杆内藻胆蛋白之间、杆与核之间、核内不同的别藻蓝蛋白之间以及核与光系统之间的蛋白，位于藻胆蛋白多聚体的中央孔洞内。

4藻胆蛋白的分离纯化

外藻胆蛋白的分离纯化主要包括提取原料、细胞破碎法和分离纯化3个方面。

藻胆蛋白的提取原料主要来自于红藻和蓝藻;细胞破碎的方法主要有反复冻融法、化学试剂处理法等5种方法;提取的方法主要有盐析法等3种;分离纯化的方法主要有层析法等3种。

【4】

4.1提取原料

藻胆蛋白的提取原料来自于红藻和蓝藻提取藻胆蛋白的原料不同,藻胆蛋白的含量也有所不同,要根据自己的试验需要选择合适的原料进行提取,才能得到较高的得率。

4.2细胞破碎

藻胆蛋白属于胞内蛋白质,要提取分离藻胆蛋白,首先必须要破坏藻类细胞的细胞壁、细胞膜,使藻胆蛋白以溶解的状态释放出来,并保持其活性。

传统的细胞破碎法有反复冻融法和超声波破碎法。

使用反复冻融法时结冰时间和结冰、溶解次数对藻胆蛋白的提取量有重要影响。

一次冷冻8h以上或4h重复冻融2次后,其色素蛋白含量趋于稳定,该法操作简单、方便,适用于实验室中少量藻体材料的处理。

超声波破碎发常作为辅助方法,还须与其它方法合用以最大限度破碎细胞,且超声波破碎细胞产热较大,易引起藻胆蛋白的变性,多用在实验室操作。

此外常用的细胞破碎方法还有组织捣碎法，化学试剂处理法，渗透压破碎法，高压匀浆法，液氮研磨法等。

【5】

4.3分离纯化

传统的藻胆蛋白分离纯化多是提取后的藻胆蛋白经过一系列的层析柱组合分离纯化藻胆蛋白。

近年来,还出现了一步层析法、利凡诺法和双水相萃取法等新的分离纯化手段。

常用的层析方法主要有吸附层析法，凝胶层析法，离子交换层析法等。

双水相萃取法具有操作步骤少,时间短,回收率高等优点,同时能使藻胆蛋白在一相中浓缩,并且得到的藻胆蛋白纯度较高。

利凡诺沉淀法能避免层析等繁杂步骤,提高效率。

5藻胆蛋白间的能量传递

由大量光谱和生物化学研究表明藻胆体由周边到核心形成一系列递减的能量阶梯,从而可使吸收的能量高效地传到光反应中心。

利用时间分辨光谱方法可以定量描述能量在杆中传递的动力学特征.利用化学键连方法合成了藻胆体杆模型复合物,通过稳态荧光光谱测得能量RPE到CPC的传递效率为88%.皮秒级时间分辨的荧光光谱证明能量传递的时间常数约为80ps。

【6】

藻胆体复合物的能量传递过程可用以下图示表示【7】

藻胆蛋白包含大量的赖氨酸残基，B-PE分子含有约85个赖氨酸残基，而APC含36个。

通过这些赖氨酸残基侧链，藻胆蛋白可与其它生物大分子相偶联。

常用的方法是使用异双功能试剂（如SPDP等）与待偶联的大分子反应，使其衍生化；以吡啶二硫化物使藻胆蛋白巯基化，再将两者按一定比例混合并温育，得藻胆蛋白共价偶合物。

在提纯藻胆蛋白偶联产物时，凝胶过滤不失为一种有效手段。

以琼脂糖凝胶为填料的层析柱，其分离效果就很理想。

此外，基于羟基磷灰石的离子交换色谱也较为实用。

6应用及展望

6.1藻胆体和藻胆蛋白的应用

藻胆体和藻胆蛋白可以作为天然色素应用于食品、化妆品和染料等。

同时还可以开发为药品和保健品。

制成荧光试剂，用于临床医学诊断、免疫化学和生物工程等，藻胆蛋白作为荧光标记物具有以下优点：

稳定性好，易保存，PH4—11光谱无明显的变化，色基多，吸光能力强，荧光量子产量高，BPE荧光强度为荧光素的14.5倍。

荧光位于橙红光区（550-700nm），背景光干扰少，斯托克位移大，荧光素＜30nm，藻胆蛋白≥80nm，等电点在PH4.7-5.3，在生理溶液中带负电荷，非特异性吸附极少，天然生物大分子不淬灭其荧光，分子表面-SH，-NH2等活性基团多，易交联等。

例如以藻红蛋白作为示踪剂应用于脑积水引流中，使用的PE与传统的研究脑内大分子引流的示踪剂相比具有明显的优势，首先它是一种蛋白性示踪剂，又没有放射性污染，而且所发荧光比常用的异硫氰荧光素强14倍。

6.2前景展望

藻胆蛋白是一种新型活性物质,由于藻胆蛋白的生物活性广泛,所以具有良好的应用价值;而且我国的海域宽广,藻类产量很大,藻类资源十分丰富。

但是目前开发利用的力度和深度还很小,大部分仅限于简单的食用,繁杂的分离纯化工艺使它的应用受到了限制，而藻胆蛋白对人类的贡献和作用是显而易见的。

因此,应该充分利用我国海产资源丰富的优势,改进藻胆蛋白提取、纯化的的方法,将藻胆蛋白开发成具有生产规模化的产品。

参考文献

【1】WalterA.Sidler，PhycobilisomeandPhycobiliproteinStructures

【2】NicoleTandeaudeMa