细胞免疫荧光实验步骤Word文档下载推荐.docx
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g/ml二抗（1：
200）37℃避光孵育细胞1小时。
10）PBS洗涤，5分钟×
11）1µ
g/mlDAPI染色15分钟，使用时避光。
12）PBS洗涤，5分钟×
13）以及分数90%甘油封片，盖玻片细胞面朝下。
14）荧光显微镜下观察。
活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备
（一）制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）
↓
用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×
10６～１×
10７／ml
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）
的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20（用DPBS
稀释）灭活正常兔血清
↓4℃30min
用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×
5min
弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠
（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇
↓ 4℃30min
用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右
加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入
1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
视细胞浓度加入100～500μl固定液）
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
（标本在试管中可保存5～7天）
（二）试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项
1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1.DPBS（×
10,贮存液）
NaCl80g
KCl2g 蒸馏水加至1000ml
Na２HPO４11.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH２PO４2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS50ml（终浓度 5％）
4％NaN３50ml（终浓度0.2％）
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g（终浓度2％）
甲 醛 10ml
NaN３ 0.2g（终浓度0.02％）
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
NaN３ 0.2g（终浓度0.02％）
严重同意楼上的讲解。
我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤一次，二抗后没有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反应！
排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。
我想请问楼上：
NaN３哪里有卖？
谢谢！
我找过，发现它是一种化学工业产品，成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！
是不是不是同一种东东？
我做的是zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×
PBS洗3次，每次10分钟
3、4％的甲醛室温固定20－30分钟
4、1×
5、0.2％TritonX－100透化2－5分钟
6、1×
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜
9、1×
10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光
11、1×
12、95％甘油封片
注：
4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×
PBS稀释
从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光
我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：
有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2.4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3.0.2％TritonX－100通透10分钟，PBS洗三遍。
4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：
1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
我要做的是occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个合适
各位同仁:
我现在急于做人乳腺癌细胞MCF-7的免疫荧光实验，目的是测凋亡时，基因bax、bcl-2的蛋白表达变化。
不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。
请高手指教。
万分感谢！
能发一个邮件更好，再一次感谢！
我的E-mail：
hudaxj2005@
抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可.之后片子可保留更长时间
bu不是原创
我是做悬浮细胞THP-1的，是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵育次数多了会越洗越少，请问各位怎么洗法细胞不会变少。
（离心转速比较重要，还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越少）
顶一下
我也遇到了同样的问题，不知那位高人能够指点迷津？
另悬浮培养的细胞是不是也需要先固定在做后面的处理？
我听说悬浮细胞是最后一步才固定，我的实验步骤中太多道听途说啊，没办法，找不到完全相同的文献，很多protocol都是针对贴壁细胞。
。
不是悬浮细胞，是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定
鬼笔环肽编辑
与鹅膏蕈碱（amanitin）一起存在，毒性比鹅膏蕈碱弱，对小鼠的致死剂量是50微克，对人体也有很强的毒性，可引起流涎、呕吐、便血、发绀、痉挛、肌肉挛缩，以致死亡。
它同细胞松弛素B的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。
它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合的特殊性质使得它具有一个颇富前景的用途：
通过让这种毒素吸附于荧光染料上面，研究人员可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。
通过这些观察，他们可以揭开癌症工作机制和组织生长之谜。
美国加州大学圣克鲁斯分校的两位化学家斯科特·
洛基和劳拉·
舒利斯科（LauraSchuresko）利用一种称为固相合成（solid-phasesynthesis）的手法，制造出这种致命物质。
他们不是将几种化学物质放入烧瓶混合，让它们自由飘浮，而是在化学反应期间对其中一种化学物质进行适当约束，这样一来，研究人员在复杂的化学反应过程中可以更好地对其进行控制。
FITC和Rhodamin等荧光物质标记的鬼笔环肽可特异的与真核细胞的F-actin结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。
鬼笔环肽的配制：
0.1mg鬼笔环肽溶于1ml无水甲醇（也可用DMSO或无水乙醇溶解）配成贮存液，可在-20度避光的条件下长期保存，工作液的浓度为5ug/ml，由贮存液加生理盐水PBS稀释20倍即可。
染色程序：
生理盐水PBS清洗细胞2次，每次10分钟；
3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定20分钟，生理盐水PBS清洗细胞2次；
加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽室温染色30-60分钟，夏季时间可以短一些，生理盐水PBS清洗细胞2次；
DAPI或hoechst33258染细胞核10分钟，生理盐水PBS清洗细胞2次；
吸去多余水分，加荧光封片液（中性或偏碱性缓冲液加等量甘油），盖上盖玻片，荧光或共聚焦显微镜下观察。
注意事项：
鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITONX-100处理。
药品价格昂贵，0.1mg的售价接近两千元，要节约使用。
毒性较大，戴上手套操作。
1DAPI介绍编辑
在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。
当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。
DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。
DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein,GFP）或TexasRed染剂（红色荧光染剂）的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。
DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。
使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。
DAPI
中文名：
4，6-联脒-2-苯基吲哚（?
）
英文名：
4'
6-diamidino-2-phenylindole，2-（4-amidinophenyl）-1H-indole-6-carboxamidine，DAPIdihydrochloride
分子式：
C16H15N5
结构式：
DAPI的结构
分子量：
277.324
CASnumber：
28718-90-3
光谱性质：
DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm
与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358nm/461nm；
与RNA结合时，最大发射移动到400nm左右。
2DAPI染色原理编辑
染色原理：
DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。
显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高（几乎为100%），且对活细胞无毒副作用。
DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。
DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。
细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。
a、正常的烟草细胞核：
核形完整，染色质均匀。
b、染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。
c、染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。
d、细胞核破裂形成碎片，核解体。
3染色步骤编辑
在细胞移植前，将DAPI以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI，再用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM培养基制成细胞悬液以备用。
存储条件：
-20℃避光保存
每次使用，用量较少，可反复冻融，无需分装
1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。
2、贮存液用70%酒精配制，浓度100&
micro;
g/ml，可用黑纸包住，长期冻存。
使用液按1:
1000用PBS稀释，最终浓度100ng/ml。
3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。
封闭剂在细胞免疫荧光中的应用
日期：
2012-08-20
来源：
互联网
标签：
免疫荧光
封闭液
封闭剂
相关专题：
生物实验中的封闭剂
摘要:
BSA可以用来封闭，网上查到的浓度0.5%到2%都有，1%比较常见。
孵育一抗之前要加，封闭孵育时间过后，加一抗之前不要洗掉，只移除多余液体即可.之后不需要再封闭，但是一抗和二抗都应该用含有BSA的缓冲液来稀释。
有些人还加tween来减少非特异性结合。
封闭抗原也可以使用二抗抗体所属动物种类的血清.没有统一固定的浓度要看情况。
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I、步骤：
一、固定：
PBS
5min×
3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT静置15min。
PBS5min×
3次振荡洗涤。
二、通透化：
通透液覆盖细胞，RT静置30min。
三、封闭：
封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：
一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
五、二抗孵育：
fitC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<
60min。
3次避光振荡洗涤。
六、染核：
新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<
10min。
七、封片：
在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：
1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相;
分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：
1、固定液：
4%多聚甲醛/PBS：
4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1nNaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：
0.5%（v/v）TritonX-100/PBS
3、封闭液：
正常山羊血清稀释于PBS;
或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：
Hoechst33258即可。
5、封片剂：
50%（v/v）甘油/PBS
最近做细胞免疫荧光标记，发现非特异标记很多，对照组（不加一抗）和正常组（加一抗二抗）基本没什么区别。
疑似封闭液出了问题。
是否要用羊血清封闭？
但是很多人都有用到BSA；
还是BSA浓度太小了？
上网查，众说纷纭。
我的方法如下
1、4%冷多聚甲醛4度固定20min，PBS洗三遍，每次5min
2、0.2%Triton透化处理20min，室温，PBS洗三遍，每次5min
3、0.5%的BSA（牛血清白蛋白）20min封闭，室温。
不洗，倾倒掉多于液体。
（以上在24孔板中操作）
取一载玻片，把爬片正置在载玻片上进行一下操作。
可避免因孔板孔太大太大而浪费抗体。
4、一抗（兔抗鼠。
1：
100）孵育过夜4度，然后取出，正置于孔板中，PBS洗三遍，每次5min，取出，把爬片正置在一干燥载玻片上进行以下操作。
5、二抗（羊抗兔。
160）室温1小时，注意避光（可放置在饭盒中），在二抗孵育40min是加Hoechst33258染色液染核20min，），然后取出正置于培养皿中，PBS洗三遍，每次5min
6、蒸馏水洗掉PBS，60%缓冲甘油封片
7、倒扣于载玻片上或是大的盖玻片上，镜下观察。
普通MTT法实验步骤：
1：
接种细胞：
用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2:
培养细胞：
同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：
呈色：
培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul.继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：
比色：
选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤贴壁细胞：
1:
收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000-
10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2:
5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3:
5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4:
每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5:
终止培养，小心吸去孔内培养液。
6:
每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7:
同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
悬浮细胞：
收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×
106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul；
②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培养液稀释（储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:
10-1:
20）；
③需检测物10ul；
④细胞悬液50ul（即5×
104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100ml1640）2:
置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3:
每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：
一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：
与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。
其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
（4）MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
（5）用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定（6）一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ulDMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
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