园林植物遗传育种学实验指导文档格式.docx
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为了保证实验课的教学效果，要求同学们必须以事实求实、严肃认真的科学态度进行实验，不断提高独立思考和独立工作的能力。
在实验课中应注意以下几点。
1、学生要自备实验指导书及实验报告纸、实验记录本等用具。
2、每次实验前，要提前预习实验指导书上的有关内容，以明确该次实验的目的，了解实验的内容和方法步骤。
3、进入实验室后，应按所在组的位置就位，为各组配备的实验仪器和材料不得随便挪动和乱放。
未经教师允许，不得乱动室内仪器、药品和用具，以免影响实验。
4、实验前组长领取或清点本组的实验用具，实验后如数交回；
贵重仪器在实验前后均应由使用者填写使用记录；
实验中所用各种化学药品，要严格按照规范使用；
凡不遵守实验规则而造成仪器、用品损坏或者丢失者，视情况按学校有关规定由本人赔偿经济损失。
5、实验过程要认真仔细地按照实验指导书的要求进行，切实熟练掌握实验观察要点及操作技术，有疑问可随时与老师或者同学商讨解决，切忌在实验室嬉闹或喧哗。
6、写实验报告时要抓住重点来进行文字记载或者绘图制表，绘图时要正确、整洁、美观。
实验报告按时上交。
7、实验结束后，应将仪器装好，器具清洗干净，摆放整体。
由值日同学打扫卫生。
关好门窗、电源及水龙头后才能离开实验室。
二〇〇七年六月
前言
《园林植物遗传育种学实验指导书》是为园林专业编写的。
园林植物遗传育种学实验是学好和掌握园林植物育种的基本原理、基本知识和基本操作技能的主要环节。
加强实验和实践教学，对培养学生创新精神、动手能力有至关重要的作用，有利于学生对本门课程教学内容的全面了解和掌握，有利于增强学生分析和解决问题的能力以及创新精神的培养，有利于学生掌握先进的育种技术。
该书由张菊平和陈迪新老师收集整理和编撰，由于时间和水平有限，书中定有不当之处，恳请批评指正。
编者
2007年6月
实验一分离规律的验证1
实验二独立分配规律和连锁规律的验证4
实验三植物细胞有丝分裂的观察7
实验四花粉生命力的鉴定10
实验五园林植物种质资源调查13
实验六单株选择14
实验七植物有性杂交15
实验八植物多倍体诱导17
实验九花粉母细胞减数分裂制片法18
实验十人工诱变21
实验十一园林植物遗传力的估计24
实验十二园林植物花器结构及开花授粉习性的观察26
实验十三植物培养基的配制与灭菌28
实验十四园林植物的组织培养31
实验十五植物基因组DNA的提取33
实验一分离规律的验证
一、目的
1.通过对玉米果穗标本的观察，验证并加深理解遗传学三个基本规律。
2.掌握对植物材料杂种后代分离情况进行分析的基本方法。
二、材料及用具
杂种玉米F2分离果穗标本；
手揿计数机。
三、原理
分离规律指出，相对的性状由相对的两个遗传因子控制，一个来自父方，另一个来自母方。
两个遗传因子在体细胞内成对存在。
当杂种形成时，成对因子彼此分离，因此，每个配子内只含有相对因子的一个。
杂种产生的不同类型的配子，数目相等，并且各种异性配子相互结合的机会均等，从而使杂种植株在自交或测交的情况下，表现出一定的比例（3∶1或1∶1）。
以玉米性状分离和配子分离来证实。
玉米籽粒有胚、胚乳和果皮三部分。
由于形成种子前双重受精的结果，胚为二倍体（2n），胚乳为淀粉层和糊粉层均为三倍体（3n），它们性状发育的方向是由父母本的遗传基础共同决定的，当代表现亲本显性性状。
因此如父本花粉中含有显性基因时，它所决定的性状就能在当代母本籽粒上表现出来，这种现象叫“花粉直感”。
果皮是由子房壁及珠被发育而成，属母本体细胞组织。
它的性状发育是由母本的遗传型决定，与当代授粉作用无关，不表现“花粉直感”。
性状分离：
玉米胚乳中淀粉层的性状有甜（su）与非甜（Su），糯质（wx）与非糯质（WX），凹陷（Sh）与饱满（sh）等，主要受一对基因的控制。
当具有隐性甜胚乳（susu）性状的个体授以显性非甜（SuSu）胚个体的花粉时，由于花粉直感作用，当代就能得到非甜种子（Susu）。
由它长成的F1植株在形成性细胞时，相对基因Su、su发生分离，产生两种类型的配子Su、su，其数目相等。
F1植株与隐性亲本（susu）测交后，得到甜与非甜为1∶1的分离比例，自交则产生甜与非甜为3∶1的比例。
配子分离：
杂合非糯玉米株在花粉粒上的分离，直接证明配子发生分离，也直接说明了相对基因的发生分离。
纯合糯玉米（wxwx）产生的花粉粒含支链淀粉，与碘作用呈蓝黑色，杂合非糯性玉米（WXwx）则产生上述两种数目相等的花粉粒，用碘染色后，半数花粉粒呈蓝黑色，半数花粉粒呈红棕色，由此证明，基因的分离是在形成孢子的减数分裂过程中。
如果F1植株上形成的花粉是1∶1的，在其自交所形成的F2穗上将会有3/4种子为非糯，1/4种子为糯质，如下表。
F1卵细胞
F1花粉
WX
wx
WXWX（非糯）
WXwx（非糯）
wxwx（糯）
非糯∶糯=3∶1
用I2-KI对F2的种子逐粒染色就可以看出结果，假如是3∶1，则说明F1花粉定是1∶1，粉质玉米与甜质玉米的遗传关系同非糯与糯性完全相似，粉质玉米的胚乳或花粉遇到I2-KI溶液呈蓝黑色，甜质的则呈棕红色。
四、实验方法
观察一对基因杂种，如：
Susu；
Wxwx等的自交与测交果穗标本并计数，将统计数字填入下表，并进行适合度测定，检查其是否符合一对基因的自交3∶1和测交1∶1的分离结果。
籽粒类型
观察数（o）
理论数（e）
偏差（d）
d2/e
显性
隐性
总数（∑）
注：
对分离个体进行分析时，观察数与理论数往往有出入，须根据实得比数符合理论比数程度判断这次实验结果是否可用这一理论比数来说明，还是必须抛弃这个理论比数另有其它比数。
分离类型只有两组时，测定适合度的方法根据观察数（o）与理论数（e）之间的偏差（d=o-e）除标准差Se（Se=
，C2，C2分别为两组期望个体数，n为总数），商小于2则机率P>
0.05，表示差异不显著，纯由机会产生，实际数与理论数相等。
若商大于2，则实际数与理论数不符。
五、作业
列表统计一对基因杂种自交和测交的果穗标本，并进行适度性测定。
附录1玉米生活周史
玉米的同一植株上着生雌花序和雄花序，它们分别产生大孢子和小孢子，所以玉米植株是雌雄同株的，是孢子体。
雄花着生在茎端部。
在雄花序里，雄花药的表皮下出现孢原细胞，孢原细胞经过几次分裂，成为小孢子母细胞（2n）。
小孢子母细胞经过两次减数分裂形成四个小孢子花粉粒（n）。
小孢子经过一次有丝分裂，产生两个单倍体核，其中一个核不再分裂，成为管核或营养核（n），另一个核再进行一次有丝分裂，成为两个雄核（n）。
这样，雄配子体成熟，花粉粒内含有三个单倍体核。
在玉米植株上部叶腋间生几个雌花序，在雌花里，雌蕊基部的子房中出现孢原细胞，这个孢原细胞发育成为大孢子母细胞（2n）。
大孢子母细胞经过两次减数分裂，产生四个单倍体核（n），其中三个退化。
留下来的大孢子又经三次有丝分裂，形成8个单倍体核的胚囊（配子体）。
在这8个核中，位于顶端的三个核继续分裂，为反足细胞；
两个核移至中部，成为极核，还有三个核移至胚囊底部，构成两个助核和一个卵核。
授粉后，花粉萌发，花粉管沿着花柱长到胚囊，一个雄核跟卵核结合，产生二倍体核（2n）；
另一个雄核跟两个极核结合，产生一个三倍体核（3n），两个雄核分别跟胚囊中的卵核和极核结合的过程，叫做“双重受精”。
经多次有丝发裂二倍体核形成胚，三倍体核形成胚乳。
表示配子体（n）世代和孢子体（2n）世代的交替
附图1玉米生活周史
附表Ⅰ不同偏差/标准差的机率表
自
由
度
几率（p）
0.99
0.95
0.50
0.30
0.20
0.10
0.05
0.01
0.001
1
0.0002
0.004
0.46
1.07
1.64
2.71
3.84
6.64
10.83
2
0.02.
0.103
1.39
2.41
3.22
4.60
5.99
9.21
13.82
3
0.115
0.35
2.37
3.66
4.64
6.25
7.82
11.34
16.27
4
0.71
3.36
4.88
7.78
9.49
18.47
5
0.55
1.14
4.85
6.60
7.29
9.24
11.07
15.09
20.52
实验二独立分配规律和连锁规律的验证
1.通过两对性状的杂交实验，验证基因的独立分配原则。
2.通过对二对或三对连锁遗传的相对性对性状的杂交实验，验证基因的连锁交换原则，并掌握基因定位的基本方法。
二、材料
1.玉米各种性状籽粒杂种F1的自交及侧交果穗。
2.玉米紫色糊粉质，饱满，非糯性籽粒自交系与褐色糊粉层，凹陷，糯性籽粒自交系的杂种F1与褐色、凹陷、糯性亲本侧交的果穗。
三、仪器及用品
铅笔、橡皮、报告记载表、计算器
四、原理
1.植物在形成配子时减数分裂中，位于非同源染色体上的基因，随着所在染色体，在各自独立分离的基础上，自由结合起来，从而形成各种可能组合的配子。
因此将两对性状具有差异的亲本杂交，如果这两对性状受两对基因的控制，都有显隐关系。
分别存在于两对染色体上，那么F1将产生4种不同的配子，理论上数量相等。
F2有9种基因型，按表现型归纳为4种，比例为9∶3∶3∶1，F1与双隐性材料测交，后代分离为1∶1∶1∶1。
但是基因与性状的关系不一定是一对一的关系，比如植物中有些性状涉及到两对独立遗传的基因，F2的分离比例，不是9∶3∶3∶1，而是9∶3∶3∶1的变形，这就表明非同源染色体及其上的基因之间，照例进行了独立分配，只是由于基因数目和互作方式的不同，使杂种后代表现型的种类及其分离比例，发生了种种变化而已，如互补作用、抑制作用、隐性上位作用。
基因的独立分配，是生物变异的重要来源，也是人类选育新品种的基础。
玉米果皮色泽的形成，主要决定于两个显性基因，即位于第3染色体上A1与第1染色体上的P。
当显性基因A1存在时，可将无色的前体转变为棕色化合物，显性基因P则进一步将棕色化合物转变为红色色素，因此，A1-P-基因型植株表现为红果皮。
A1-pp基因型植株为棕果皮。
没有显性基因A1的植株（a1a1P-与a1a1pp）均表现为无色果皮，显示a1对P具有上位性作用，如以棕果皮（A1A1pp）与无色果皮（a1a1PP）植株杂交，F1（A1a1Pp）表现为红果皮，F29红色（A1-P-）∶3棕色（A1-pp）∶4无色（3a1a1P-+1a1a1pp）的分离比例。
2.植物在形成配子时减数分裂中，位于同源染色体上的基因，往往有保持其原来组合状态随同所在染色体一道遗传的趋势，也可能随着姊妹染色单体的片段交换而交换，从而产生各种可能组合的配子，总是亲型配子较多，重组型配子较少，因此将两对相对性状具有变异的亲本杂交，如果这两对性状受两对基因的控制，每对都有显隐关系，共同存在于一对同源染色体上，那么F1可能产生4种不同的配子，数量不相等，亲型的多，重组的少，F2中将分离出4种类型，但不成9∶3∶3∶1的比例，而且是亲型个体数多于按独立分配的理论预期数值，重组型个体数少于按独立分配的理论预期数值，F1与双隐性材料杂交，后代的分离，也不按独立分配1∶1∶1∶1的比例，而且亲型个体较多，重组型个体较少，形成配子时有关基因间交换了多少，可用重组型配子数占总配子数的百分比表示之，把它叫做交换率。
基因在染色体上相距越近，交换机会越少，交换率越低，反之越高。
经测定，特定基因间的交换率是相当恒定的，因此交换率的大小可以作为衡量基因距离的尺度，将1%的交换率作为一个遗传距离单位，根据交换率，可以确定不同基因在染色体上的相对位置。
经典遗传基因定位的方法是作两点测验或三点测验。
每次取两对性状研究，包括一次杂交，一次测交（也可自交）。
测定有关的两种基因间的交换率，叫做两点测验，通过三次两点测验，可以确定三种基因的排列顺序及其相对距离，取三对性状同时进行研究，包括一次杂交，一次测交，同时测定有关的三种基因间的交换率，叫做三点测验，通过一次三点测验，即可确定三种基因的位置。
连锁基因的交换，是生物变异的来源之一。
连锁与交换的实验结果，提供了基因存在于染色体上的证据，论证了基因在染色体上的线性排列，并为遗传工程研究，提供了基本资料。
五、方法
（一）观察两对基因杂种A1a1Susu自交与测交果穗的标本分离情况，并计算、整理列入下表。
将观察到的果穗标本有关性状的实际粒数与理论值进行卡方测定。
果穗号
项目\表型
有色非甜
A1-Su-
有色甜
A1-susu
无色非甜
a1a1Su-
无色甜
a1a1susu
偏差（d=o-e）
差方（d2）
差方/理论数
d2/e
当子代个体数分成两类以上时，用卡方测定适合度更为可靠。
将观察数及期望数代入公式：
X2=∑[（o-e）2/e]，求出X2值后，根据自由度N（N=分离类型组数-1），查附表Ⅱ，求出机率P，P>
0.05为适合，P<
0.05为不适合。
（二）取玉米籽粒的紫色与褐色、饱满与凹陷、非糯性与糯性三对相对性状，同时进行观测，杂交果穗上F1的籽粒全为紫色、饱满、非糯，测交果穗中应有8种不同的类型。
1.仔细观察鉴定，准确无误地进行记数，记入下表。
测交后代表现型
F1配子基因型
交换类别
粒数
交换率（%）
紫色、紫色、非糯
褐色、褐色、糯
无交换
饱满、褐色、糯
凹陷、紫色、非糯
单交换Ⅰ
饱满、紫色、糯
凹陷、褐色、非糯
双交换Ⅱ
饱满、褐色、非糯
凹陷、紫色、糯
双交换
合计
2.分析方法：
（1）确定三种性状的关系：
全部独立遗传，或一个独立两个连锁，或三个都连锁。
（2）确定各种交换类型：
测交后代中数量最少的类型为双交换型，最多的为无交换型，中间的为单交换型。
（3）确定三种基因的排列顺序：
在双交换后代中，有两个性状出现了还原亲本的组合类型，则第三个性状的基因必在其中。
假如双交换后代中，出现了饱满与非糯性籽粒，与一个亲本性状组合相同，又出现了凹陷、糯性籽粒，与另一个亲本性状组合相同，则紫色与褐色这对基因必在其中。
（4）计算交换率：
交换率=[（单交换Ⅰ粒数+双交换粒数）/总粒数]×
100%
交换率Ⅱ=[（单交换Ⅱ粒数+双交换粒数）/总粒数]×
3.绘制染色体图：
按基因排列顺序，以1%交换率为一个遗传距离单位，依比例绘图。
六、作业
1.将观察结果填入表中，并检验。
2.求交换率，进行基因定位，并附染色体图。
实验三植物细胞有丝分裂的观察
1.学习植物细胞涂抹制片技术。
2.观察了解有丝分裂过程中染色体形态变化。
二、原理
各种旺盛生长的植物组织，包括茎尖、根尖、孢原组织等分生组织、愈伤组织及分化的小孢子、萌发的花粉管，经常进行着细胞分裂。
有丝分裂是植物细胞增殖的主要方式，有丝分裂期间，细胞核内每一染色体均进行自我复制，分裂期间，染色体变化不同，可分为：
间期、前期、中期和末期。
①间期（interphase）：
是分裂前的准备时期，核内发生着一系裂的生化变化，主要是DNA复制和能量的积累，以保证分裂的进行，在分裂间期，细胞核的结构具有明显的核膜、核仁及染色质或染色质丝。
②前期（prophase）：
核内染色质粒或染色质丝逐渐汇合并缩短变形成染色体。
每一染色体纵裂为二，着丝点不分开。
每条染色体是由两条共着丝点的染色单位组成。
核仁、核膜消失，两极出现纺缍丝。
③中期（metaphase）：
染色体逐渐集中于细胞中部，成一排与赤道面上，这时纺锤丝的一端连接染色体着丝点，另一端集中于细胞的极处构成纺锤体，由于染色体收缩，而形成明显的具有一定数目和形态的物质，因此，这个时期是染色体计数和形态观察的最适期。
染色体向赤道移动，最终有规律地排列细胞中部的赤道面上，由两极伸出的纺缍丝与染色体上的着丝点相连形成纺缍体。
④后期（anaphase）：
每条染色体的着丝粒分裂为二。
每条染色体上的两染色单位，随着丝点的分离而分离，每条染色单体都具有自己的着丝点。
纵裂的染色体单体被纺缍丝拉向两极，成为独立的染色体，在两极方向上出现了数目与母细胞相同的染色体群。
呈I型和丁型。
⑤末期（telophase）：
两组子染色体到达两极，染色体螺旋结构消失，核仁、核膜重新出现，纺缍体消失。
随纺锤体解体，在细胞赤道板上形成细胞壁，成为两个细胞，完成有丝分裂过程。
⑥胞质分割（cytokinesis）：
位于赤道板的纺缍丝逐渐收缩增厚形成细胞板，最后成为细胞膜，一个细胞被分隔成两个子细胞。
有丝分裂结束。
有丝分裂是均等的分裂过程，染色体一分为二，均匀分配到每个子细胞中，其结果，母细胞与子细胞，子细胞之间，染色体数目和组成完成相同，由此推断，生物细胞遗传物质的正确传递，与染色体准确复制和均等分配有关，支配生物性状表现的物质，主要存在于细胞核中的染色体上。
植物根尖分裂区是细胞分裂的旺盛区，其细胞核内的染色体在8-羟基喹啉（或对二氯苯）作用下，刺激染色体收缩，变粗，且避免染色体在细胞中凝聚一团，再经过盐酸等物质处理。
使细胞之间的壁溶解，固定杀死细胞。
染色体经过适当的取材处理，制片后可进行有丝分裂中染色体动态的观察，这是遗传学上通过细胞分裂观察染色体行为、形态结构、数目，从而进行组织分析，鉴别杂种等常用的制片方法。
涂抹制片法可在短期内获得清楚的有丝分裂图像。
三、材料
中国水仙、风信子、柴万年青、郁金香、洋葱根尖细胞。
四、仪器和试剂
镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸、单刃刀片、显微镜、擦镜纸、培养皿、标签纸、纱布、瓷盘、棕色试剂瓶、容量瓶、小吸管、酒精灯
8-羟基喹啉（或对二氯苯）、1NHCl、醋酸地衣红、冰醋酸、乙醇（100%、95%）、中性树胶，卡诺固定液、蒸馏水。
五、步骤
1.预处理：
实验前将鳞茎水培，待根长出约1~1.5cm时，剪取0.5cm长的根尖，立即放入对二氯苯饱和水溶液中，在室温下处理2h左右。
预处理的作用主要是浓缩染色体，使之分散，同时抑制纺缍丝形成。
在制片过程中，如发现染色体后期的分裂相较多时，说明预处理时间不够。
2.固定：
倒掉对氯二苯溶液，用水冲洗两次，用新配的卡诺固定液固定24h后，放入冰箱中备用。
如果要长期保存则要将根尖转入70%的酒精中。
3.解离：
先将固定后的根尖用蒸馏水换洗3~4次，再用1NHCl在60℃（注意要严格控制不超过±
5℃）的恒温水浴锅中处理10~20min，然后用蒸馏水换洗3~4次。
此步主要是使细胞之间分散开，并软化细胞壁，便于压片，同时也利于染色。
4.染色制片：
（1）切片：
剔除根冠，在生长锥处切下一小块组织。
（2）染色压片：
在切下的组织上滴一滴醋酸地衣红，捣碎，除去大块的渣滓，盖上擦干净的盖玻片，覆一层吸水纸，用食指在上面施加少量压力，勿使盖片移动，用解剖针柄轻敲，可使细胞舒展，染色体散开。
好的片子放置显微镜下检查，看到有典型的分裂图像时，可把载玻片在酒精灯上往返烘烤。
5.脱盖片：
先在制片上做好记号，以便于封片时按原位复上，在致冷调节器的冷却台上冷冻，用镊子和单刃刀片慢慢起下来。
6.封片：
冰冻脱下的盖片自然干燥后，直接用加拿大树胶或DDPX中性胶封片。
注意树胶用量要适当，以正好布满盖片为宜；
覆盖盖片时勿太快，防止气泡产生，盖片务必原位复上。
观察染色体数目，绘制你所看到的图像，并说明属于有丝分裂哪一时期？
本实验药品配制方法
1.对二氯苯饱和水溶液：
称取5克结晶放入棕色试剂瓶中，加入100mL已加温至40～45℃的蒸馏水，振荡5min，静置冷却（约1h）后即可使用。
该溶液在10～20℃条件下存放和处理为宜。
溶液用完后，可重新加入温热蒸馏水，如上法配制。
2.卡诺固定液：
纯酒精3份，冰醋酸1份，随用随配，不宜久放。
3.1N盐酸：
取浓盐酸82.15mL（比重为1.19），加蒸馏水1000mL，若比重为1.16，则取98.3mL，加水至1000mL。
4.卡宝品红（石碳酸品红）：
原液A：
3g碱性品红溶于100mL70%酒精中（可长期保存）。
原液B：
取原液A10mL，加入90mL5%的石碳酸（苯酚）水溶液中（限2周内使用，如果呈浑浊状不可再用）。
原液C：
取原液B55mL，加入冰乙酸和甲醛各6mL（可长期保存）。
染色液：
取原液10～20mL，加入45%乙酸80～90mL，再加入1g山梨醇。
室温下存放，1~2周后即可使用。
一般可保存2年有效。
5.醋酸地衣红：
先将100mL45%乙酸放入较短颈的平底烧瓶（200mL溶积）中煮沸，移去火苗，缓缓加入2g地衣红，再煮沸1~2min，冷却后
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