细胞工程复习参考Word格式文档下载.docx
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胚胎移植：
是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫技术。
胚胎分割：
借助显微镜操作技术或徒手操作方法，切割早起胚胎成2、4等多等份，再移植给受体母畜，从而创造母卵多仔后代技术。
胚胎融合：
又叫胚胎嵌合，是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。
试管动物：
将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。
体外受精：
哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
克隆动物：
用特定发育阶段的核受体体外构建重组胚，通过胚移植到受体完成发育出生的动物。
包括胚胎细胞克隆动物和细胞克动物。
核体：
与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。
胞质体：
是出去细胞核后由膜包裹的无核细胞。
微细胞：
又可被称为微核体，是指含有一条或几条染色体（即只含有一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。
细胞质工程：
研究真核细胞的核-质关系以及细胞器、细胞质基因转移的技术。
胞质杂种：
将两种来源不同的核外遗传物质（细胞器）与一个特定的核组合在一起得到的细胞。
细胞融合：
是指用人工的方法使两个或两个以上的细胞或原生质体（除去细胞壁的细胞）融合成一个细胞的技术。
体细胞杂交：
不同来源的体细胞融合并使之分化再生形成新品种的技术。
染色体工程：
按照一定的设计，有计划的消减、添加或代换同种或异种染色体的技术，从而达到定向改善遗传性和选育新品种的目的。
广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。
多倍体：
细胞中含有三个或更多染色体组的个体。
单倍体：
细胞中含有正常体细胞的一半染色体数。
温度休克法：
即用略高于或略低于动物致死温度的冷或热休克来诱导鱼类三倍体（抑制第二极体排放）或四倍体（抑制第一次卵裂）的方法。
植物细胞培养：
是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。
看护培养：
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。
饲养层培养:
用处理过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。
悬浮培养：
将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状态的培养方式。
细胞固定化：
将游离的细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一门技术。
毛状根：
植株或组织、器官、受到发根农杆菌感染后形成的类似头发一样的根组织。
植物细胞两步培养：
第一步采用利于细胞生长的培养基使细胞达到高的细胞浓度；
第二步更换为利于产物合成的培养基或者添加代谢产物的前体物质或诱导子促进产物合成。
动物细胞培养：
模拟动物体内的生理环境使细胞在体外生存、增殖的一种技术。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究的时期。
原代培养：
接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培养，在首次传代前的培养。
传代培养：
将原代培养的细胞继续转接培养的过程。
动物细胞大规模培养：
在人工条件下，在生物反应器中（设定pH、温度、溶氧等）高密度大量培养细胞用于生产生物制品的技术。
细胞系：
由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的细胞群体。
细胞株：
从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）：
经过免疫的哺乳类动物单一的B淋巴细胞可以分泌单一性抗体，这种具有特异性的、同质性的抗体为单克隆抗体。
HAT培养基：
:
含有次黄嘌呤（hypoxanthine）、A:
氨甲蝶呤（aminopterin，）及T:
胸腺嘧啶核苷（thymidine）三种关键成分，具有筛选杂交瘤细胞功能的培养基。
胚胎干细胞（ESC）：
从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能干细胞，是可以分化成任何一种组织类型的细胞。
成体干细胞（ASC）：
是成体组织内具有更新和进一步分化潜能的细胞，为多能或单能干细胞
多能干细胞：
能够形成两种或两种以上类型的干细胞，如骨髓造血干细胞
转基因动物（Transgenicanimal）：
是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定遗传给后代的基因工程动物。
转基因生物反应器（Transgenicbioreactor）：
将外源基因转入细胞或动植物，利用细胞增殖或者动植物代谢制备外源基因的表达产物的技术。
组织工程（TissueEngineering）：
是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或器官再生的一门技术。
二、问答题
1、细胞培养有哪些主要设备及用途?
细胞培养设备主要包括水处理设备、无菌设备、培养设备、观察分析、分离与保存设备等。
（1）水处理设备主要包括蒸馏水发生器、超纯水系统。
（2）无茵设备主要有超净工作台、过滤除苗器、高压灭苗锅等。
为实验提供无菌环境。
（3）植物细胞培养设备主要包括光照培养箱或生化培养箱、控温摇床等，为细胞生长提供稳定的温度、适当的湿度、光照等条件。
动物细胞培养的主要仪器有CO2培养箱，使培养条件维持在37℃、5％CO2等恒定条件。
（4）细胞观察采用显微镜，包括倒置显微镜、普通光学显微镜等。
细胞形态与结构的精细表征需要扫描电子显微镜和透射电子显微镜。
其他设备还包括流式细胞仪、显微操作仪、细胞融合仪等。
（4）细胞分离主要使用离心机，包括高速、低速和常温、冷冻离心机。
（5）试剂保存设备主要有普通冰箱，细胞保存采用—80℃超低温冰箱或液氮罐。
2、如何测定细胞活力？
依据的原理是什么？
细胞活力指总细胞中话细胞所占的百分比。
（1）台盼蓝染色法用0.5％的台盼蓝对细胞进行着色，在显微镜下观察，由于活细胞具有还原性，细胞不被染色，镜下呈无色透明状，死细胞无还原性，呈深蓝色。
（2）MTT（甲基噻唑基四唑）法。
利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应测定细胞相对数和相对话力。
四陛盐是一种接受氢离子的染料，活细胞中琥珀酸脱氢酶能将四陛盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨，并沉淀在细胞内和细胞周围中。
甲暨结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。
死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将四唑盐还原。
3、试述细胞培养的灭菌方法和各自的适用范围。
（1）物理灭菌法
紫外线消毒：
用于空气、操作台表面和不能使用其他方法进行消毒的培养器皿的消毒，可以消灭空气中大部分细茵，培养室的紫外线灯应距地面不超过2.5m，消毒时物品不宜相互遮挡。
湿热消毒：
即高压蒸汽消毒，主要用于培养液、培养器皿等的灭菌。
过滤除菌：
主要用于气体的除茵。
对于不能耐受高温的培养用液、血清、酶液等也采用过滤法除菌。
（2）化学消毒法：
最常用的是70％乙醇，0.5%过氧乙酸，主要用于操作者的皮肤、操作台表面及无菌室内的壁面处理。
（3）抗生素消毒：
在细胞培养时，在培养基中添加青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。
4、试述细胞冻存的主要方法。
（1）缓馒冷冻法：
将处于0℃或其他预处理温度的材料以1-2℃/min的降温速度从起始温度降到—100℃，稳定1h后投人液氯中保存或以此降温速度连续降温至—196℃。
（2）预冷冻法：
包括两步冷冻、逐级冷冻两种，前者是将预处理后的材料先通过缓慢冷冻法降温至—40℃，保存一段时间（约30min）后，再投人液氯中保存。
后者将经过预处理的材料先制备成不同温度等级的溶液，并在每级温度中停留一定时间，然后将材料投入液氮中保存。
（3）快速冷冻法：
将材料从0℃或者其他预处理温度直接投人液氮中保存o
5、试述人工种子的制作流程。
（1）选择目标植物
（2）从合适的外植体诱导愈伤组织
（3）将愈伤组织转移到液体培养基中扩大增生
（4）愈伤组织转移到无激素培养基中培养至体细胞胚
（5）胚状体同步发育
（6）人工种皮制备、胚乳配制
（7）包埋，可使用干燥法和水凝胶法
（8）贮存，一般贮存在4-7℃低温，小于67%相对湿度的条件下。
可采用添加防腐剂、抗生素、控制糖含量、种皮外包裹滑石粉、液体石蜡油等，可延长贮存时间
6、植物组织培养中的调节物质有哪些？
各有何作用？
（1）生长素：
主要用于刺激细胞分裂和诱导根的分化
（2）细胞分裂素：
主要引起细胞分裂，诱导芽的形成和促进芽的生长
在植物组织培养中，当细胞分裂素对生长素你浓度比值高时，诱导芽的形成；
反之，则促进根的生成。
（3）赤霉素：
促进细胞生长，与生长素一起可诱导细胞分化
7、试述植物组织培养的步骤（过程）
（1）选择外植体，根据欲培养的植物选择合适的组织切段或植物，并清洗、消毒
（2）接种在培养基上，形成愈伤组织
（3）诱导根、芽的形成
（4）进一步发育成试管苗
（5）练苗、移栽
（6）进一步发育成完整植株
8、植物组织培养中经常会遇到哪些问题，如何解决？
（1）玻璃化/过度水化现象。
适当提高光照强度；
注意通气，尽可能降低培养容器内的空气相对湿度和改善氧气供应状况；
适当降低培养基中NH+4浓度；
控制温度，适当进行低温处理，避免过高的培养温度；
注意细胞分裂素和生长素的配合以及激素和K+之间的配合使用
（2）褐变。
选择适宜的外植体，首选处于生长旺盛时期的材料，选择适宜的培养条件；
在培养过程中经常进行细胞筛选；
对较易褐变的外植体材料进行预处理，减少醌类物质的产生，以减轻褐变；
使用抑制剂（抗氧化剂）和吸附剂（如PVP）。
（3）微生物污染问题。
改进外植体消毒方法，采用间隙消毒法；
反复检查培养物，在初代培养成功后要反复检查，不要急于扩大繁殖；
使用抗生素
9、植物脱毒主要的方法和特点是什么？
如何鉴定脱毒植物？
脱毒方法：
（1）物理方法
a.高温处理：
又称热疗法。
仅对一些圆形病毒或者线状病毒有效，对于杆状病毒效果不好，且高温处理也容易使植物材料受热枯死，造成损失。
包括高汤处理、热风处理
温汤处理:
简便易行，适于离体材料和休眠器官的处理，但易伤害材料。
热风处理：
应该根据植物种类、器官类别和生理状况及待脱除病毒的种类等确定处理温度与处理时间。
b.低温处理：
降低温度能使病毒活力下降
（2）化学方法：
利用嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等化学药品处理患病植物可以抑制植物体内病毒的复制。
一些化学物质在某些程度上可抑制病毒复制，但不能使病毒失活，且对植物有毒害
（3）生物方法：
选择不带病毒的外植体来再生植株就可以达到去病毒的目的。
包括茎尖培养、微体嫁接法、愈伤组织诱导脱毒、珠心培养法、花药培养脱毒。
脱毒植物鉴定：
（1）直接检测法：
直接观察植物茎、叶等器官有无病毒引起的症状，但只能定性
（2）指示植物法：
指采用对某种病毒反应敏感，症状明显的植物来检测病毒，具体方法有摩擦接种法和嫁接法，但只能定性
（3）电镜法：
超薄切片后采用电子显微镜观察样品材料有无病毒存在，可鉴定病毒颗粒大小、形状和结构
（4）抗血清检测法：
病毒携带抗原，注射进动物体内会在血清中产生抗体得到抗血清。
不同病毒产生的抗血清具有高度的特异性和专一性。
可定性和定量
（5）分子检测技术:
利用已知病毒的核苷酸序列设计引物，采用PCR技术体外扩增病毒的DNA片段，或者通过探针杂交等分子技术检测。
细胞工程作业2（第六、七、八章）
1、试管动物培育的步骤是什么？
①精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养；
②体外受精；
③重组胚激活与体外培养；
④胚胎移植；
⑤体外发育、出生。
2、核移植动物与体外受精动物相比有怎样的优缺点？
核移植优点：
能克服远缘杂交的不亲和性，在目的地培育优良品种，动物体细胞克隆，可用于保存濒危物种、保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等。
缺点：
技术复杂，难度大：
它将对生物多样性提出挑战，有性繁殖是形成生物多样性的重要基础，而“克隆动物”则会导致生物品系减少，个体生存能力下降。
3、细胞核移植克隆动物的技术路线。
①核供体细胞的获得与取核②受体细胞的准备与去核③细胞核移植④重组胚的激活与培养⑤胚胎移植⑥核移植后代鉴定。
4、如何分离X精子和Y精子?
在胚胎移植前进行性别鉴定的方法和依据是什么？
①免疫学分离法：
Y精子存在H-Y抗原，利用H-Y抗体检测精子质膜上是否存在H-Y抗原。
②离心分离发：
X精子DNA含量略大于Y精子，因此X精子密度较Y精子略大。
③电泳分离法：
Y精子负电荷略少于X精子，利用表面电荷差异采用电泳进行分离。
④流式细胞仪分离法：
根据X、Y精子上DNA含量的微小差别分离。
⑤化学药品处理法：
Y精子有嗜碱性，而X精子有嗜酸性。
5、胚胎移植前性别鉴定
细胞生物学方法：
通过判定胚胎细胞性染色体是X还是Y来鉴定胚胎的性别。
分子生物学方法：
根据Y染色体的SRY基因的有无进行鉴别，可用DNA探针法和PCR扩增法。
生化分析法：
——胚胎H-Y抗原检测法
相关酶分析法：
通过测定与X染色体相关的酶（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）活性来达到鉴别胚胎性别的目的。
6、何谓细胞重组？
细胞重组的方式有哪些？
细胞重组又叫细胞拆合，指从活细胞中分离出细胞器及组分，在体外将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。
细胞重组的方式
①胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。
②微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。
③胞质体与核体重新组合形成重组细胞。
其中最后一种是非常重要的细胞重组技术。
7、试述细胞融合的方法和各自的特点。
①生物法
有仙台病毒法等。
各种病毒都具有凝集细胞的能力。
仙台病毒除有凝集细胞的能力外，还具有促使凝集的细胞发生融合的能力。
融合随机，融合率低。
要提前培养病毒，并且灭活后才能使用，一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。
因此，目前已经很少使用。
②化学法
最常用的方法：
PEG结合高Ca2+——高pH诱导法诱导
有点：
融合成本低，产生异核率高，不受物种限制，融合率高
过程繁琐，可能对细胞有毒害。
③物理法
优点：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小；
方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程；
免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。
可能会造成不可恢复的细胞损伤。
8、细胞融合后如何筛选？
融合后细胞的种类
未融合的细胞
同核体——同源原生质体的融合体。
异核体——非同源原生质体的融合体。
多核体——含有双亲不同比例核物质的融合体。
选择性培养基筛选法：
利用原生质体或细胞对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞的方法，是常用的筛选方法。
抗性互补筛选系统：
利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞的方法。
营养互补选择系统：
利用两种亲本细胞营养互补作用原理筛选杂种细胞的方法
温度敏感突变型融合细胞的筛选：
在低温和高温下均能生长为杂种细胞
物理特性筛选法：
利用亲本细胞与杂种细胞的物理特性的差异进行选择
荧光素标记法：
利用亲本细胞与杂种细胞的不同荧光标志用荧光显微镜或流式细胞仪进行选择。
9、试述体细胞杂交的过程（步骤）：
亲本选择；
原生质体制备；
融合细胞（杂种细胞）筛选；
融合细胞（杂种细胞）的培养（细胞壁再生、分裂形成细胞团、愈伤组织）
由愈伤组织再生植株；
杂种植物鉴定。
10、如何进行体细胞杂交后的鉴定？
形态学鉴定：
根据茎、叶、花等组织的形态、颜色来鉴别杂种。
两亲本的亲源关系较远时，杂种植物的形态倾向于亲本之一，但存在差异。
细胞学鉴定：
原生质体融合的亲本材料一般为二倍体，杂种细胞的染色体应该为双二倍体。
如果亲本的亲缘关系较远，染色体差异会较大；
同时，杂种细胞中一亲本的染色体可能会另外一亲本的排斥，可能会产生大量非整倍体。
因此可以从杂种植物染色体的形态、大小和数目上鉴定是否是杂种植物。
同工（isoenzyme）鉴定：
杂种植物的同工酶谱是双亲本酶谱的总和，表现为条带增多、酶带颜色加深、宽度加大，有时还出现两亲本都不具有的新谱带或者丢失部分亲本酶带。
DNA分子标记鉴定：
是在分子水平对亲本和杂种植物遗传形状差异进行鉴定，能正确揭示出生物个体间核苷酸序列的差异。
12、植物和动物多倍体育种方法有哪些？
如何获得异源多倍体植物？
植物多倍体育种方法
①物理因素诱导：
温度骤变、机械创伤、电离和非电离辐射、离心力等
②化学因素诱导：
秋水仙素是至今发现的最有效、使用最为广泛的染色体加倍诱导剂。
③生物方法：
主要指杂交，利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交繁殖多倍体后代，经常与化学、物理方法结合使用。
动物多倍体育种方法
A物理方法
①温度休克法：
即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体（抑制第二极体排放）或四倍体（抑制第一次卵裂）的方法。
多用于鱼类三倍体培育。
通过温度调控技术诱导多倍体是物理方法中简便而效果佳的方法之一。
②水静压法：
采用较高的水静压（如65kg/cm2）可抑制卵母细胞第二极体的释放或者抑制第一次卵裂诱导产生多倍体的方法。
该方法诱导率较高、处理时间短、对卵子操作等优点。
但需专门的设备如水压机等。
B化学法
细胞松弛素诱导法：
细胞松弛素B（CB）导致极体的保留是通过阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离来实现。
CB处理比其他物理方法如温度、水压等能更有效地诱导三倍体的形成。
6-甲氨基嘌呤诱导法：
6-DMAP是一种蛋白激酶抑制剂。
当6-DMAP与微管蛋白二聚体结合以后对微管正常的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生三倍体。
C生物学方法
主要是通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体。
多倍体倍性鉴定的方法
①染色体计数
由于染色体制片技术比较成熟，因此染色体技术仍是目前鉴定多倍体倍性的一种最为直观、准备的方法、但缺点是比较费时。
②核体积测量法
一般细胞核的体积与染色体数目成正比，可借测定细胞核的体积鉴定染色体的倍性。
比较费时，缺乏准确性。
③DNA含量测定
是倍性鉴定的另一个比较有效的直接鉴定的方法。
是较为先进常用的方法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但是缺点是这种一起比较昂贵。
④生化分析
根据二倍体与多倍体间可能存在的不同组织细胞蛋白和酶的活性差异，通过生化方法进行鉴定。
不具有普遍性的意义。
单倍体鉴定
①形态鉴定：
通过观察花药和花粉植株的形态特征进行染色体的倍性鉴定。
生长发育弱，体型小，各器官明显减小。
鉴定准确率低。
②结实性鉴定：
单倍体开花但不结实；
二倍体植株则开花结实都正常；
四倍体植株虽能开花但通常结实性不良。
③染色体数目鉴定：
染色体数目是花药和花粉植株倍性的直接证据，因而是花和花粉植株倍性鉴定的重要方法。
④生化标记鉴定：
生化标记是指以基因表达产物蛋白质为主的一类标记系统，常用的是同工酶标记。
⑤分子标记鉴定：
根据植物基因组DNA水平差异进行检测。
第三次作业
1、与微生物相比，植物细胞培养有哪些特点？
（1）植物细胞直径一般为10～200um，平均直径比微生物细胞大30～100倍。
（2）植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。
（3）植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。
（4）与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2～3周，半连续或连续培养时间一般长达2～3个月。
（5）植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。
（6）植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。
2、植物单细胞分离与初步培养
分离方法：
（1）机械法：
通过机械磨碎、切割等操作获得游离的细胞，效率低，容易对细胞造成损伤。
（2）酶解法：
选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质降解，从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。
经常采用的生物酶包括：
琼脂酶、果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。
（3）愈伤组织法：
通过培养植物外植体诱导产生愈伤组织，并使其大量增殖，再通过机械振荡或者酶解的方法使细胞分离从而获得游离的细胞。
培养方式：
（1）看护培养:
具体方法：
将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。
优点是简便，成功率高。
缺点是不能在显微镜下直接观察。
（2）饲养层培养:
用处理过的（如x射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。
具体方法有以下4种：
1）饲养细胞与靶细胞共同混合于琼脂培养基中。
2）饲养细胞与靶细胞分别混合于琼脂培养基中，前者放于下层，后者位于上层。
3）饲养细胞与靶细胞一起培养于液体培养基中。
4）双层滤纸植板培养：
在饲养层细胞和靶细胞层之间放两张滤纸，上面一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养基上继续培养。
3、如何获得适合工业化生产的细胞株。
（1）愈伤组织的诱导与培养：
选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。
愈伤组织形成后，进行继代培养。
（2）单细胞分离：
选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。
（3）细胞无性系的分离：
转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。
（4）细胞株筛选：
检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。
（5）性能评价：
进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。
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