乳酸菌的分离纯化 毕业设计1Word文档下载推荐.docx
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生命科学学院生物技术专业学号：
指导教师：
易立副教授
摘要：
本文对乳酸菌的分离纯化，革兰氏染色以及抑菌实验进行阐述，从市售酸菜中分离纯化得到乳酸菌，革兰氏染色进行鉴定，最后进行金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌实验！
实验主要是分离纯化，革兰氏染色，最后用抑菌实验比较单菌株的抑菌能力。
关键词：
乳酸菌：
分离纯化；
革兰氏染色；
抑菌
乳酸菌（LAB，Lacticacidbacteria）是指能使碳水化合物（主要为葡萄糖）发酵产生大量乳酸的细菌的通称，这类细菌生长在矿物质和有机营养丰富的微酸性环境中[1,2]。
在自然界中比较常见，用途广泛，它可以改善食物的风味，并延长食品的货架期，作为保健食品和药品，可以改善和提高人的健康水平，延年益寿，还可以作为微生物学和微生态学领域研究的模式生物[3]。
酸菜是世界性大众化蔬菜腌制品,在我国历史悠久[4]，其自然发酵的主要菌群是乳酸菌[5]。
人体在摄人发酵酸菜时，也同时摄入了大量的乳酸菌体及其代谢产物[6]。
乳酸菌是酸菜发酵过程中的有益菌，在发酵速度以及发酵产品品质等方面都起到至关重要的作用。
因此在微生物学和食品科学的研究中，对酸菜中乳酸菌进行鉴定是必要的[7]。
本实验从酸菜中分离纯化得到6株乳酸菌（1,2,3,4,5,6），进行革兰氏染色，为紫色杆状，最后进行抑菌实验，比较6株乳酸菌的抑菌能力。
1材料与仪器
1.1菌种
乳酸菌
1.2样品来源
市售新鲜酸菜
1.3培养基
（1）乳酸菌分离培养基（固体MRS培养基）：
蛋白胨5g，酵母膏2.5g，牛肉膏5g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸铵1g，乙酸钠2.5g，硫酸镁0.29g，硫酸锰0.125g，吐温800.5mL，琼脂8.5g，蒸馏水500mL，pH7.0
（2）乳酸菌纯化培养基：
MRS培养基+1%的碳酸钙溶液（碳酸钙1g，蒸馏水100mL）
（3）乳酸菌富集培养培养基（液体MRS培养基）：
蛋白胨5g，酵母膏2.5g，牛肉膏5g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸铵1g，乙酸钠2.5g，硫酸镁0.29g，硫酸锰0.125g，吐温800.5mL，蒸馏水500mL，pH7.0
（4）抑菌实验培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：
牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，NaCl2.5g，琼脂粉7.5g，水500mL，pH7.2
1.4仪器及用具
恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养皿，锥形瓶，移液枪，涂布棒，接种针
2方法与过程
2.1酸菜中菌种的分离培养（平板涂布法）
吸取汤汁0.1ml，加入9ml无菌水中进行100倍稀释，依次做5个梯度，每个梯度分别取0.2ml涂布于灭好菌MRS培养基中，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，然后用封口膜封住培养皿，平放于试验台上20min，然后倒置于37℃恒温箱中培养48h。
2.2酸菜中菌种的纯化培养（平板划线法）
48h无菌条件下，从培养基中挑选不同的菌落，放入1.5ml无菌水中稀释，用接种环挑取菌液，用平板划线法接入含有1%碳酸钙的MRS培养基，用封口膜密封培养皿，倒置放在37℃恒温培养箱中培养48小时。
2.3革兰氏染色
在洁净的载玻片上加蒸馏水一滴，然后用接种环分别挑选取少量培养基透明圈中的单菌落与水滴混匀，涂开，而后将此玻片在酒精灯火焰上通过3—4次，使细菌固定在载玻片上。
然后，加草酸铵结晶紫液，染1—2min，水洗并除尽水滴。
然后在涂片上滴加碘液，染1—2min除尽水滴。
而后在涂片上，滴加复红乙醇溶液，维持1min，水洗，用吸水纸轻轻吸干，最后进行油镜镜检。
2.4抑菌实验
首先用打孔器制作药敏片并高温灭菌。
然后把培养在液体培养基里的乳酸菌倒在灭过菌的培养皿上，做好的药敏片放在里边浸泡20分钟左右，拿出来沥干（药敏片仍然是湿的，但是没有水珠）。
其次，倒平板，分别涂布金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
最后，每个培养皿放4个药敏片。
用封口膜密封培养皿，倒置放在37℃恒温培养箱中培养24小时。
2.5保种
甘油和乳酸菌菌液1:
1放在冻存管中，放在冰箱—20℃保存。
3实验结果
3.1分离培养结果
乳酸菌菌落大约1-3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色。
3.2纯化培养结果
分离纯化放在一起，是一个统一的过程，需要看到的是单菌落照片，这几张照片没任何体现。
3.3革兰氏染色结果
紫色棒状乳酸菌，证乳酸菌为革兰氏阳性菌
3.4抑菌实验结果
分离得到的6株乳酸菌
金黄色葡萄球菌抑菌效果
大肠杆菌抑菌效果
4数据分析
表1金黄色葡萄球菌抑菌圈直径长度
分组
1
2
3
4
5
6
直径长度（cm）
17
22
19
15
16
14
18
10
13
12
11
平均值（cm）
16.5
16.25
12.75
15.75
表2大肠杆菌抑菌圈直径长度
直径长度（cm）
20
9
11.5
12.25
13.25
13.5
表3两种菌抑菌圈直径长度平均值比较
金黄色葡萄球菌抑菌圈平均值（cm
）
大肠杆菌抑菌圈平均值（cm
13.75
17.25
14.25
11.875
14.5
通过表格可以看出抑菌效果有高到低依次排序为：
2>
5>
3=6>
1>
5讨论
乳酸菌（LAB）及发酵产物数千年的利用历史及无毒副作用的优良品质使其被认为是GRAS（generallyrecognizedassafe公认安全）菌[8]。
其发酵产物也是安全物质，特别是乳酸菌产生的细菌素具有光谱抑菌的作用，在将来能够替代化学防腐剂保藏食品，故乳酸菌及其发酵产物在食品工业上有极好的应用前景[9]。
近年来乳酸菌分离成为一个热门研究方向。
本文从市售酸菜中分离出来6株具有抑菌效果的乳酸菌，在实验过程中，要注意整个过程无菌操作，防止杂菌污染。
乳酸菌需要厌氧环境，需要用保鲜膜包裹。
参考文献：
[1]杨洁彬．乳酸菌一生物学基础及应用[M]．北京：
中国轻工业出版社，1996：
235—214．
[2]刘爱民．微生物资源与应用[M]．南京：
东南大学出版社，2008（6）：
19—27．
[3]张刚．乳酸细菌一基础、技术和应用[M]．北京：
化学工业出版，2006（10）：
129—134．
[4]赵佳锐，杨虹．益生菌降解胆固醇的作用及机理研究进展[J]．微生物学报，2005，315—318．
[5]RMartin，NSober6n，FV6zquez，eta1．Lamicrobiotavaginal：
com—Posici6n，papelprotector，patologiaasociadayperspectivasterap6u—ticas[J]．EnfermedadesInfecciosasyMicrobiologiaClinica，2008，26：
160—167．
[6]燕平梅，薛文通，畅晓晖等．自然发酵和接种发酵方法对白菜品质的影响[J]．农业工程学报，2008，24（3）：
286—290．
[7]孙庆申，王艺，杨丽娟，吴桐，韩德权，曹相辉，李晓娣等．复合酸菜发酵剂乳酸菌的优选及鉴定[J]．黑龙江大学工程学报，2013，4（4）：
35—40．
[8]BURDOCKGA，CARABINIG．Generallyrecognizedassafe（GRAS）：
historyanddescription[J]．Toxicologyletters，2004，150
（1）：
3-18．
[9]胡美忠，张新卓，刘芸等．贵州铜仁产广谱抑菌作用细菌素乳酸菌的筛选及鉴定[J]．铜仁学院学报，2014,16（4）:
32—36．
Isolationandpurificationoflacticacidbacteriaandinhibitingbacteriatest
Gouqianqian
Collegeoflifesciencesbiotechnologyprofessionallearning:
111344045
Supervisor:
AssociateProfessorYiLi
Abstract：
Thisarticleonseparationandpurificationoflacticacidbacteria,Gramstainingandbacteriostaticexperimentofelaborate,separationandpurificationoflacticacidbacteriafromtheSauerkrautonthemarket,Gramstainingidentification,andfinallythebacteriostatictestofStaphylococcusaureusandEscherichiacoli!
ExperimentistoisolateandpurifytheGram-staining,andfinallywithbacteriostatictestcomparedtothebacteriostaticabilityofstrain.
Keywords：
Lacticacidbacteria;
isolation;
purificationandGramstaining;
bacteriostatic
Author：
Studentnumber：
Tutor：
Yili
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