05与10年药典无菌对比Word文档格式.docx

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9.离心沉淀集菌法取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。

10.无

11.无

12.无

13.菌液的制备及保存：

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。

14.无

15.无

16.取按验证的方法制备的均匀供试液，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：

10、1：

100、1：

1000等稀释级。

17..平皿法：

采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。

取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

18.培养和计数除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小时的菌落数报告；

霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；

必要时，可适当延长培养时间至5~7天进行菌落计数并报告。

19.菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌宜平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

（1）当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（2）当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。

若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；

若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落乘以稀释倍数的值报告菌数，当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。

（3）当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1小时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

20.无

21.供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。

每片滤膜的总过量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

22.取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液

23.菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；

若滤膜上无菌生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数。

24.控制菌检查方法的验证菌种及菌液制备同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。

25.验证方法

（1）试验组取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

（2）阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。

方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；

验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。

阴性对照菌不得检出。

26.结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。

若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；

若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

27.无

28.无

29.疱肉培养基

30.无

31.无

32.无

33.无

34.无

35.微生物限度标准单位：

个

36.眼部给药制剂

总则1.供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。

2.除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃。

3.检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml、10cm<

为单位报告，特殊品种以最小包装单位报告。

膜剂为100cm<

5.要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g用于阳性对照试验）。

供试液制备若需用加温时应均匀加热，且温度不应超过45℃。

7.增加贴膏剂供试品

取规定量供试品，去掉贴膏剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。

用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。

然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，制成供试液。

贴膏剂也可以其他适宜的方法制备成供试液。

8.当供试品有抑菌活性时，采用下了方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。

9.离心沉淀法取一定量的供试液，以500转/分离心3分钟，取全部上清液混合，用于检查。

10.细菌、霉菌及酵母菌计数

计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。

11.适用性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；

取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数；

取白色念珠菌50～100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

12.结果判定被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。

判该培养基的适用性检查符合规定。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

14.细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

表1常见干扰物的中和剂或灭活方法

干扰物

可选用的中和剂或灭活方法

戊二醛亚硫酸氢纳

酚类、乙醇、吸附物稀释法

醛类稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐

季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯、卵磷脂、聚山梨酯

汞类制剂亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐

双胍类化合物卵磷脂

碘酒、洗必泰类聚山梨酯

卤化物硫代硫酸盐

乙二胺四乙酸（EDTA）镁或钙离子

磺胺类对氨基苯甲酸

.-内酰胺类抗生素.-内酰胺酶

15若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。

但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。

因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。

若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。

计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。

16.取按验证的方法制备的均匀供试液，用稀释液稀释成1：

1000等稀释级的供试液。

17.平皿法

取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

18.培养和计数除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数;

必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。

19.菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu之间、霉菌宜平均菌落数小于100cfu之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm<

供试品中所含的菌数。

如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1小时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

20.若采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。

21.供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为不超过100ml。

总冲洗量不得过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。

22.取相当于每张滤膜含1g或1ml或10cm<

供试品的供试液

23.菌数报告规则以相当于1g、1ml或10cm<

供试品的菌落数报告菌数；

若滤膜上无菌生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm<

供试品），或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数。

24.控制菌检查方法的验证菌种及菌液制备同控制菌检查用培养基的适用性检查

25.验证方法

取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

26.结果判断若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；

27.控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。

检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。

菌种对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。

大肠埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）〔CMCC（B）26003〕

乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）〔CMCC（B）50094〕

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）〔CMCC（B）10104〕

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）〔CMCC（B）64941〕

白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕

菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。

用0.9%无

菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。

适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查所用的菌株及检测项目见表2。

表2控制菌检查用培养基的促生长、抑制和指示能力检查增菌培养基促生长能力检查：

分别接种不大于100cfu的试验菌（见表2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

固体培养基促生长能力检查：

取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最

短培养时间下培养。

被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。

培养基抑制能力检查：

接种不少于100cfu的试验菌（见表2）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。

固体培养基指示能力检查：

取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见

表2）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。

被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

液体培养基指示能力检查：

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。

28.白色念珠菌（Candidaalbicans）取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养48～72小时。

取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板

上，培养24～48小时（必要时延长至72小时）。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。

若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白

色念珠菌。

如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48小时（必要时延长至72小时）。

若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。

若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80-玉米琼脂培养基上，培养24～48小时。

取培养物进行染色，镜检及芽管试验。

芽管试验挑取1%吐温80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3小时，置显微镜下观察，可见到由孢

子长出短小芽管。

若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。

29.无

30.梭菌增菌培养基

31.沙氏葡萄糖液体培养基

32.沙氏葡萄糖琼脂培养基

33.念珠菌显色培养基（CHROMagar）

34.1%吐温80-玉米琼脂培养基

cfu

36.无