RT-PCR实验方法总结大全.doc

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RT-PCR实验有三步：

抽提RNA，RT，PCR。

要求：

1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.RT按要求做，一般不会出太大问题。

3.PCR，按常规。

但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？

必须

在RT时，引物设计有3种方法即a：

Random9mers；b：

OligodT-AdaptorPrimer；和c：

特异的下游引物。

如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR的模板继续扩增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？

http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov

问题：

在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！

（注：

已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）

从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？

请高手指教！

解答：

1.RT-PCR有两种做法：

条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。

但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。

（promega）。

2.RT-PCR应具备的条件

高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。

3.RACE

我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无

RT-PCR的常用内标b－actin和GAPDH的使用有选择性吗？

比如不同的细胞，不同的刺激。

有关内参：

RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。

问：

我曾经作过同一管的PCR，内有actin和目的基因引物。

虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。

请教mxbdna2003，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？

答：

 itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitityofthePCR.itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplate<（forRTandPCR）andbettrerforpublicationandeditorifhedonnotknowthepreoceduremuch.buttheamountjustusing"accuratepiptte"iswrong.itshoudberememberedtodotheinnercontrolofhousekeepinggeneeverytime.

在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。

Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。

能看到均一条带就很好了。

关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。

有关内参的建议：

一定要做内参的，每一次，我想。

不作内参的结果是不可信的

电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。

2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。

关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。

看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。

我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。

烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。

给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在***帖过。

关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。

引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。

我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。

我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？

18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。

18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。

我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。

更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。

PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。

正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。

有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？

原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。

正义反义也容易理清。

我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。

因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：

做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。

  记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。

后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。

尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问：

1引物的特异退火温度怎样设定？

可以根据gc和at含量算出吗？

可以用引物报告单上的Tm值吗？

2PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？

MgCl2应加多少？

各个成分的量有无确定标准？

3PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？

与cDNA的量少有关吗？

Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.

20中是指体积还是量?

只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.

如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。

而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。

因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。

RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。

在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。

这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。

而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

一、防止RNA酶污染的措施

1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：

是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2.异硫氰酸胍：

目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

3.氧钒核糖核苷复合物：

由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑